2149
правок
Изменения
→Ретровирусы
'''Жизненный цикл'''. Геном ретровирусов состоит из плюс-цепи РНК. Оболочка ретровирусов образуется из мембраны зараженной клетки и содержит вирусные белки. Для репликации генома и сборки вирусов необходимы три вирусных гена — gag, pol и env. В зараженной клетке путем обратной транскрипции на матрице вирусной РНК происходит образование двухцепочечной ДНК (провируса), которая затем встраивается в клеточный геном. Это обеспечивают вирусные белки — обратная транскриптаза и интеграза. Для проникновения провируса в ядро необходимо разрушение ядерной оболочки клетки, происходящее в ходе митоза. Встроившийся в клеточный геном провирус использует аппарат клетки для транскрипции вирусныхмРНК, их процессинга и трансляции. Жизненный цикл вируса завершается с синтезом новых плюс-цепей РНК на матрице провируса. Специфическая последовательность в молекуле РНК (psi) дает сигнал сборки, после чего новые вирусы отпочковываются от поверхности клетки.
[[Image:Gud_5_1.jpg|250px|thumb|right|Рисунок 5.1. Использование ретровирусного вектора. А. Схема получения ретровирусного вектора.]]
'''Конструкция и получение вектора'''. Ретровирусные векторы получают из соответствующего провируса. Гены gag, pol и env удаляют, чтобы освободить место для нового генетического материала и предотвратить репродукцию вируса (рис. 5.1). В ретровирусный вектор может быть включено до 8000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Поскольку рекомбинантный вирус не может синтезировать вирусные мРНК, то в трансфицированных клетках отсутствует и синтез вирусных белков, которые могли бы вызвать иммунный ответ. Вместе с геном, предназначенным для лечения, в вектор можно ввести промотор и энхан-сер, обеспечивающие эффективную экспрессию трансгена и, в ряде случаев, ее тканеспецифичность. Можно использовать также вирусные промотор и энхансер, расположенные в области длинных концевых повторов (LTR).
После удаления генов, кодирующих вирусные белки и обеспечивающих репродукцию вируса, вирус способен репродуцироваться только в специально созданных линиях упаковывающих клеток, синтезирующих эти белки (рис. 5.1). В геном этих клеток встраивают вирусные гены (gag, pol и env) таким образом, чтобы они находились на разных хромосомах. Это снижает вероятность обратной рекомбинации этих генов в исходный вирусный геном и образования вирусов, способных к репродукции. После введения рекомбинантной ДН К провируса в упаковывающие клетки последние начинают производить ретровирусный вектор. ДНК провируса вводят в виде плазмиды, в которой между двумя длинными концевыми повторами заключены небольшой участок гена gag с сигналом сборки и чужеродные гены. Трансфекцию упаковывающих клеток осуществляют стандартным методом. Разработано несколько модификаций этого подхода, призванных снизить вероятность рекомбинации с образованием вируса, способного к репродукции (Jolly, 1994). '''''Описание к рисунок 5.1.''' Использование ретровирусного вектора. А. Схема получения ретровирусного вектора. Для получения не способных к репродукции ретровирусных векторов используют специальные линии клеток, способные синтезировать те вирусные белки, гены которых удалены при конструировании вектора. В клетки подходящей линии (например, эмбриональные клетки почки человека) с помощью бактериальных плазмид вводят гены gag (G), pol (Р) и env (Е). Клетки, синтезирующие соответствующие вирусные белки, называют упаковывающими. Затем плазмиду, содержащую рекомбинантную ДНК провируса, в которой вместо генов gag, pol и env находится нужный трансген, используют для трансфекции упаковывающих клеток. Теперь клетки содержат все, что нужно для сборки вирусов, и ретровирусные векторы начинают накапливаться в культуральной среде. Эти векторы содержат трансген, но лишены вирусных генов gag, pol и env, а потому при заражении следующей клетки они не могут репродуцироваться. Б. Экспрессия трансгена в клетке-мишени после внедрения РНК-содержащего ретровирусного вектора (см. «Жизненный цикл»).''
'''Клетки-мишени'''. Способность вируса избирательно заражать определенные типы клеток в значительной степени определяется взаимодействием между белком внешней оболочки вируса (у ретровирусов кодируется геном env) и соответствующим мембранным рецептором клетки. Вирус лейкоза мышей Молони является экотропным, то есть заражает только клетки мышей. Для расширения круга клеток-мишеней используют ген env штамма 4070А вируса лейкоза мышей. Этот штамм является амфотропным и заражает клетки не только мышей, но и других млекопитающих, в том числе — человека. Псевдотипирование, то есть упаковка вирусного генома в оболочку, содержащую белки другого вируса, позволяет расширить круг клеток-мишеней. Например, гликопротеид вируса везикулярного стоматита, называемый G-белком (не путать с G-белками, участвующими во внутриклеточной передаче сигнала; гл. 2), легко включается в оболочку вируса лейкоза мышей Молони (Chen et al., 1996). Наличие этого белка расширяет круг клеток-мишеней и облегчает заражение. Кроме того, включение G-белка повышает стабильность ретровирусного вектора и позволяет при ультрацентрифугировании получить более высокий титр вирусов. Недостаток G-белка — его токсичность по отношению к упаковывающим клеткам. Этот недостаток можно частично преодолеть, используя упаковывающие клетки с индуцируемой экспрессией G-белка (lida et all 1996). Ретровирусные векторы, содержащие другие вирусные белки, например белки вируса лейкоза гиббонов (Gallardo et al., 1997) или вируса лимфоцитарного хориоменингита (Miletic et al., 1999), менее токсичны по отношению к клеткам млекопитающих.