4702
правки
Изменения
→Аденовирусы
'''Применение'''. В настоящее время проводится много клинических испытаний, в которых аденовирусные векторы применяют для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. При лечении наследственных заболеваний большим недостатком является непродолжительность экспрессии трансгенов и иммунный ответ на зараженные клетки. Внехромосомная локализация аденовирусного генома в клетке ограничивает продолжительность экспрессии трансгенов в активно делящихся клетках (например, клетках костного мозга или эпителия), так как деление клеток не сопровождается репликацией трансгена. Аденовирусные векторы, как способные, так и не способные к репродукции, могут найти применение в лечении злокачественных новообразований (см. ниже).
'''Безопасность'''. Основное побочное действие аденовирусных векторов — иммунный ответ, направленный против зараженных клеток. Обсуждение безопасности аденовирусных векторов особенно стимулировала смерть одного больного во время клинических испытаний (Marshall, 1999). Имеются также сомнения, что в процессе получения вектора полностью исключено образование рекомбинантного вектора, способного к репродукции. Аденовирусные векторы, предназначенные для клинического использования, нуждаются в тщательной проверке. Аденоассоциированные вирусы. Эти маленькие, лишенные оболочки вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, обладают рядом свойств, необходимых хорошему вектору. Они непатогенны, обеспечивают эффективную и стабильную трансфекцию неделящихся клеток, а кроме того, позволяют исключить экспрессию вирусных белков в зараженных клетках. Основные недостатки аденоассо-циированных векторов — маленькая емкость и трудности в концентрировании. Начались клинические испытания аденоассоциированных векторов, и есть основания рассчитывать на их пригодность для генотерапии (Monahan and Samulski, 2000).
'''Жизненный цикл'''. Для репродукции аденоассоциированные вирусы нуждаются в генетической информации вируса-помощника. В жизненном цикле аденоассоциированных вирусов выделяют две фазы. Такой вирус заражает клетку, включается в клеточный геном и в отсутствие вируса-помощника (аденовируса) остается там продолжительное время в латентном состоянии. В присутствии аденовирусов начинается активная фаза, приводящая к репродукции аденоассоциированного вируса и лизису клеток. Геном аденоассоциированного вируса содержит две открытые рамки считывания (гер и cap), ограниченные инвертированными концевыми повторами (ITR). Для репродукции вируса нужны только гены гер, кодирующие четыре белка, которые обеспечивают репродукцию аденоассоциированного вируса, транскрипцию вирусной ДНК и эндонуклеазную активность, необходимую для встраивания в клеточный геном. Структурные белки, образующие капсид вируса, кодируются геном cap. В районе инвертированных концевых повторов находятся точки начала репликации; эти повторы содержат сигналы для сборки вирусов, а также участвуют во встраивании вирусной ДНК в клеточный геном. Функция многих белков и другие особенности биологии вируса стали известны после изучения природных немодифицированных вирусов (Kotin, 1994).
Заражение начинается с прикрепления вируса к его основному рецептору на клетке — протеогликану, содержащему гепарансульфат (Summerford and Samulski, 1998). В проникновении вируса в клетку участвуют также рецептор фактора роста фибробластов и сц,Р5-интегрин (Summerford et al., 1999). Интернализация вируса осуществляется путем эндоцитоза через образование покрытых клатрином окаймленных ямок (Bartlett et al., 2000а). Внутри клетки геном аденоассоциированного вируса замыкается в кольцо и образует кольцевые конкатемеры, находящиеся вне хромосом (Yang et al., 1999). Образование этих кольцевых форм вирусного генома сопровождается длительной экспрессией трансгена (Duan et al., 1998). Природный аденоассоциированный вирус может встраиваться в ДНК человека на одном участке 19-й хромосомы (19q 13.3—qter). Рекомбинантный вирус иногда утрачивает эту способность (Rivadeneira et al., 1998). Конструкция и получение вектора. Существующие аденоассоциированные векторы получают с помощью системы трех рекомбинантных плазмид (Xiao et al., 1998). Первая плазмида содержит трансген, расположенный между двумя инвертированными концевыми повторами, вторая — гены гер и cap, а третья — участки генома аденовируса, необходимые для сборки аденоассоциированного вируса. Этот подход позволяет обойтись без дополнительного заражения продуцирующих клеток аденовирусом. Из-за небольшого размера генома аденоассоциированных вирусов в вектор можно включить не более 5200 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Это не только ограничивает размер потенциального трансгена, но и затрудняет использование специальных промоторов и энхансеров, регулирующих его экспрессию в зараженной клетке. При использовании двухвекторной системы можно вдвое увеличить емкость вектора: две половины трансгена соединяются in vivo из двух разных векторов, которые объединяются в кольцевой конкатемер внутри клетки (Sun et al., 2000; Yan et al., 2000). Таким же образом можно собирать большие гены или включать важные регуляторные элементы, слишком большие для одного вектора (Duan et al., 2000). В настоящее время основные проблемы в использовании аденоассоциированных векторов связаны с трудностями получения высокой концентрации вектора и определения его титра. Клетки-мишени. Аденоассоциированные векторы способны заражать различные клетки. В доклинических исследованиях показана эффективная трансфекция клеток скелетных мышц, ЦНС, легких, печени, ЖКТ и глаза.
'''Применение'''. Аденоассоциированные векторы начали применять в клинике: сейчас проводятся клинические испытания доставки генов в легкие и в скелетные мышцы. По-видимому, эти векторы подходят для обеспечения длительной экспрессии трансгенов в скелетных мышцах, сердце, ЦНС и других тканях. Первые результаты клинического испытания, в котором с помощью аденоассоциированного вектора осуществляли доставку гена фактора IX в скелетные мышцы больных гемофилией, оказались успешными (см. ниже). Способность этих векторов обеспечивать длительную экспрессию трансгенов, не оказывая токсического действия на клетки и не вызывая иммунного ответа, делает их перспективным инструментом лечения некоторых наследственных заболеваний.
'''Безопасность'''. Аденоассоциированные вирусы непатогенны. Первые опыты с использованием соответствующих векторов показали, что они не активируют иммунную систему. Раньше высказывались опасения, что аденоассоциированный вектор может быть загрязнен вирусом-помощником (аденовирусом), но этот риск ликвидировали новые схемы получения векторов (Xiao et al., 1998). Наконец, аденоассоциированные векторы могут встраиваться в геном клетки случайным образом, что теоретически может привести к инсерционному мутагенезу. Вероятно, необходимо сохранить в векторах способность специфического встраивания в 19-ю хромосому (Rivadeneira etal., 1998).
== Вирус простого герпеса типа 1 ==