24 300
правок
Изменения
→Технические аспекты применения методов иммуноанализа и их последствия
С методологической точки зрения приемы иммуноанализа могут быть разделены на две основные подгруппы: '''классический “конкурентный” иммуноанализ''' и '''“сэндвич-анализ"''' . В случае “конкурентного” иммуноанализа гормон, присутствующий в образце, “конкурирует” за связывание с антителами с меченой формой того же гормона, добавленного в реакционную смесь. Чем выше концентрация эндогенного гормона, тем ниже вероятность связывания с антителом меченой молекулы гормона, т. е. величина сигнала, получаемого в ходе анализа, обратно пропорциональна содержанию гормона в образце. В зависимости от типа используемой метки методы конкурентного анализа называются радиоиммунологическим анализом (RIA), иммуноферментным анализом (ИФА или EIA), люминесцентным иммуноанализом (LIA) или флуоресцентным иммуноанализом (FIA). С другой стороны, в случае “сэндвич-иммуноанализа” в реакционной смеси находятся иммобилизованные антитела, которые связывают гормон из образца, а также меченые детектирующие антитела, которые взаимодействуют с другим эпитопом на поверхности молекулы гормона, что позволяет визуализировать молекулы гормона, связавшиеся с иммобилизованными антителами: чем больше количество гормона связывается с иммобилизованными антителами, тем выше интенсивность сигнала, который дают связавшиеся с ним меченые антитела. Таким образом, величина детектируемого сигнала прямо пропорциональна количеству гормона, содержащегося в образце. Как и в случае упоминавшейся выше номенклатуры конкурентного иммуноанализа, названия разновидностей “сэндвич-анализа” происходят от типа используемой системы детекции: радиоизотопный метод (radioimmunometric assay (IRMA)), иммуноферментный (enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)), люминесцентный (luminometric assay (ILMA)) и флуоресцентный (fluorometric assay (IFMA)).
Различия в технике выполнения конкурентного иммуноанализа и “сэндвич-иммуноанализа” определяют возможности их применения и особенности интерпретации результатов. Тогда как для проведения конкурентного иммуноанализа требуется только одно антитело и, соответственно, один эпитоп, для “сэндвич-аиализа” необходимы два антитела и два различных эпитопа. Эти эпитопы должны быть пространственно разобщены, поскольку в ином случае связывание с иммобилизованным антителом будет препятствовать связыванию с мечеными антителами, используемыми для детекции, следовательно, “сэндвич-метод” применим только в случае “крупных” молекул и может быть использован для определения больших пептидных гормонов, таких, как [[инсулин]], соматотропный гормон (СТГ) или (ЕРО). В то же время небольшие пептиды ([[Кортикотропин|адренокортикотропный гормон (АКТГ)]], кортиколиберин, [[Выработка гормона роста|соматолиберин ]] и [[Синтез стероидных гормонов|стероидные гормоны ]] часто определяются с использованием конкурентного иммуноанализа. Преимущество “сэндвич-иммуноанализа” заключается в том, что для узнавания молекулы гормона требуется наличие двух независимых эпитопов, и это делает метод, по крайней мере теоретически, более специфическим и менее подверженным ошибкам, обусловленным кросс-реактивностью пептидов, имеющих похожую структуру. Кроме того, в этом случае анализируемый гормон и гормон, используемый в качестве стандарта или для калибровки системы, химически идентичны, тогда как в конкурентном иммуноанализе используемый в качестве стандарта гормон является химически модифицированным за счет связывания метки. Подобная модификация может приводить к возникновению различий в сродстве антител к естественному гормону, содержащемуся в образце, и модифицированному гормону, используемому в случае проведения анализа как конкурента.
== Стандартизация иммуноанализа ==