Вирусные векторы (генотерапия)
Источник:
Клиническая фармакология по Гудману и Гилману том 1.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.
Содержание
Вирусные векторы
Благодаря особенностям жизненного цикла вирусов, первые векторы (носители трансгенов) для генотерапии стали разрабатывать именно на их основе. Вирусы переносят чужеродные гены, которые затем способны экспрессироваться в зараженных клетках. Упрощенно вирус можно представить как нуклеиновую кислоту, упакованную в оболочку. Вирус проникает в клетку-мишень, где происходит экспрессия вирусного генома. Для создания хорошего вектора необходимо изменить некоторые свойства вируса. В большинстве случаев вирус должен быть лишен возможности к репродукции, чтобы предотвратить неконтролируемое распространение трансгена. Кроме того, часть вирусного генома необходимо удалить, чтобы освободить место для чужеродного генетического материала. Другие необходимые изменения зависят от типа вируса. Вирусные векторы широко используют в доклинических исследованиях и в настоящее время именно с ними проводят большинство клинических испытаний.
При выборе вектора необходимо учитывать некоторые важные особенности жизненного цикла и биологии исходного вируса (Robbins and Ghivizzani, 1998). Для успешной трансфекции необходимо обеспечить избирательное заражение клеток-мишеней (тропность) и последующую экспрессию трансгена. Тропность частично определяется наличием специфических мембранных рецепторов, связывающих вирус на поверхности клетки и облегчающих его проникновение внутрь. Для экспрессии трансгена необходимо проникновение вирусного генома в ядро клетки с последующей успешной транскрипцией и трансляцией. Несколько дополнительных факторов определяют продолжительность экспрессии трансгена в зараженной клетке. Наконец, на пригодность вируса в качестве вектора влияют некоторые методические аспекты генной инженерии и получения вирусного вектора. Основные вирусные векторы, используемые сейчас в клинических испытаниях или признанные перспективными, созданы на основе ретровирусов (в частности, лентивирусов), аденовирусов, аденоасоциированных вирусов и вируса простого герпеса. Ниже приведены основные биологические свойства каждого типа вирусного вектора, важные для генотерапии. Конкретное применение отдельных векторов более подробно описано далее в этой главе.
Ретровирусы
Это небольшие РНК-содержащие вирусы, способные заражать только делящиеся клетки, в которых они репродуцируются. Вирусный геном (в виде провируса) встраивается в ДНК клетки-мишени. Поэтому ретровирусные векторы теоретически способны обеспечить длительную экспрессию трансгенов в некоторых типах клеток. Большинство ретровирусных векторов получено на основе вируса лейкоза мышей Молони. Геном вируса изменен так, чтобы избежать экспрессии вирусных белков в зараженных клетках, что предотвращает развитие иммунного ответа против этих клеток. Поскольку эти вирусы заражают только делящиеся клетки, ретровирусные векторы используют в основном для трансфекции клеток ex vivo (см. ниже) или для экспериментального лечения злокачественных новообразований.
Жизненный цикл. Геном ретровирусов состоит из плюс-цепи РНК. Оболочка ретровирусов образуется из мембраны зараженной клетки и содержит вирусные белки. Для репликации генома и сборки вирусов необходимы три вирусных гена — gag, pol и env. В зараженной клетке путем обратной транскрипции на матрице вирусной РНК происходит образование двухцепочечной ДНК (провируса), которая затем встраивается в клеточный геном. Это обеспечивают вирусные белки — обратная транскриптаза и интеграза. Для проникновения провируса в ядро необходимо разрушение ядерной оболочки клетки, происходящее в ходе митоза. Встроившийся в клеточный геном провирус использует аппарат клетки для транскрипции вирусныхмРНК, их процессинга и трансляции. Жизненный цикл вируса завершается с синтезом новых плюс-цепей РНК на матрице провируса. Специфическая последовательность в молекуле РНК (psi) дает сигнал сборки, после чего новые вирусы отпочковываются от поверхности клетки.
Конструкция и получение вектора. Ретровирусные векторы получают из соответствующего провируса. Гены gag, pol и env удаляют, чтобы освободить место для нового генетического материала и предотвратить репродукцию вируса (рис. 5.1). В ретровирусный вектор может быть включено до 8000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Поскольку рекомбинантный вирус не может синтезировать вирусные мРНК, то в трансфицированных клетках отсутствует и синтез вирусных белков, которые могли бы вызвать иммунный ответ. Вместе с геном, предназначенным для лечения, в вектор можно ввести промотор и энхан-сер, обеспечивающие эффективную экспрессию трансгена и, в ряде случаев, ее тканеспецифичность. Можно использовать также вирусные промотор и энхансер, расположенные в области длинных концевых повторов (LTR).
После удаления генов, кодирующих вирусные белки и обеспечивающих репродукцию вируса, вирус способен репродуцироваться только в специально созданных линиях упаковывающих клеток, синтезирующих эти белки (рис. 5.1). В геном этих клеток встраивают вирусные гены (gag, pol и env) таким образом, чтобы они находились на разных хромосомах. Это снижает вероятность обратной рекомбинации этих генов в исходный вирусный геном и образования вирусов, способных к репродукции. После введения рекомбинантной ДН К провируса в упаковывающие клетки последние начинают производить ретровирусный вектор. ДНК провируса вводят в виде плазмиды, в которой между двумя длинными концевыми повторами заключены небольшой участок гена gag с сигналом сборки и чужеродные гены. Трансфекцию упаковывающих клеток осуществляют стандартным методом. Разработано несколько модификаций этого подхода, призванных снизить вероятность рекомбинации с образованием вируса, способного к репродукции (Jolly, 1994).
Клетки-мишени. Способность вируса избирательно заражать определенные типы клеток в значительной степени определяется взаимодействием между белком внешней оболочки вируса (у ретровирусов кодируется геном env) и соответствующим мембранным рецептором клетки. Вирус лейкоза мышей Молони является экотропным, то есть заражает только клетки мышей. Для расширения круга клеток-мишеней используют ген env штамма 4070А вируса лейкоза мышей. Этот штамм является амфотропным и заражает клетки не только мышей, но и других млекопитающих, в том числе — человека. Псевдотипирование, то есть упаковка вирусного генома в оболочку, содержащую белки другого вируса, позволяет расширить круг клеток-мишеней. Например, гликопротеид вируса везикулярного стоматита, называемый G-белком (не путать с G-белками, участвующими во внутриклеточной передаче сигнала; гл. 2), легко включается в оболочку вируса лейкоза мышей Молони (Chen et al., 1996). Наличие этого белка расширяет круг клеток-мишеней и облегчает заражение. Кроме того, включение G-белка повышает стабильность ретровирусного вектора и позволяет при ультрацентрифугировании получить более высокий титр вирусов. Недостаток G-белка — его токсичность по отношению к упаковывающим клеткам. Этот недостаток можно частично преодолеть, используя упаковывающие клетки с индуцируемой экспрессией G-белка (lida et all 1996). Ретровирусные векторы, содержащие другие вирусные белки, например белки вируса лейкоза гиббонов (Gallardo et al., 1997) или вируса лимфоцитарного хориоменингита (Miletic et al., 1999), менее токсичны по отношению к клеткам млекопитающих.
Применение. С помощью ретровирусных векторов обычно осуществляют трансфекцию клеток больного ex vivo или векторы вводят непосредственно в ткани. Первый подход требует выделения клеток больного и поддержания их в культуре, заражения клеток ретровирусным вектором и последующего введения клеток больному. Так пытались модифицировать лимфоциты и стволовые кроветворные клетки при недостаточности аденозиндезаминазы (Parkman et al., 2000) и семейной гиперхолестеринемии (Grossman et al., 1994). Аналогичным образом поступали, чтобы вызвать экспрессию иммуномодуляторов в опухолевых клетках (Lode and Reisfeld, 2000). Прямую инъекцию ретровирусных векторов пробуют применять в основном для лечения солидных опухолей (Gomez-Navarro et al., 1999).
Безопасность. Поскольку вирус встраивается в клеточный геном (что важно для длительной экспрессии), причем случайным образом, существует риск возникновения мутации (инсер-ционный мутагенез). Например, встраивание вируса может изменить функцию гена, регулирующего деление клеток, что приведет к нежелательным последствиям. Способные к репродукции ретровирусы обладают некоторой канцерогенностью, однако этого не наблюдается у ретровирусных векторов, лишенных такой способности.
Лентивирусы
Вирусы, относящиеся к этому подсемейству ретровирусов, способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки (Buchschacher, Jr. and Wong-Staal,2000). Из лентивирусов лучше всего изучен ВИЧ-1, а векторы, полученные на его основе, теоретически обладают рядом преимуществ перед описанными ретровирусными векторами. Особенно многообещающей является их способность к высокоэффективной трансфекции стволовых кроветворных клеток (Miyoshi et al., 1999). Эти векторы также могут обеспечить длительную экспрессию трансгена. Однако в силу происхождения лентивирусных векторов перед проведением клинических испытаний необходимо убедиться в их безопасности (Amado and Chen, 1999).
Жизненный цикл. Лентивирусы сходны с другими ретровирусами (Tang et al., 1999). Основное отличие, объясняющее способность лентивирусов заражать неделящиеся клетки, состоит в том, что вирусный преинтеграционный комплекс взаимодействует с ядерной оболочкой, а затем транспортируется через нее. Этот преинтеграционный комплекс состоит из вирусного генома (в виде ДНК), интегразы и белка матрикса, кодируемого геном gag. Белок матрикса содержит последовательность, обеспечивающую связывание вируса с порой ядерной оболочки. Последующий перенос внутрь ядра делает возможным интеграцию вирусного генома в ДНК неделящейся клетки.
Конструкция и получение вектора. Лентивирусные векторы лишены способности к репродукции благодаря удалению из генома ВИЧ-1 некоторых дополнительных генов, поэтому для их получения используют упаковывающие клетки, в которых независимые гены кодируют необходимые для сборки вируса компоненты (Srinivasakumar and Schuening, 1999). Это существенно снижает риск рекомбинации при получении вектора, в результате которой теоретически возможно восстановление способности вируса к репродукции. Удаление гена tat и длинных концевых повторов (LTR) также снижает риск восстановления способности к репродукции при получении вектора или in vivo.
Клетки-мишени. Лентивирусные векторы способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, например стволовые кроветворные клетки или специализированные клетки — мышечные, нейроны, гепатоциты, фоторецепторы сетчатки. Однако иногда для осуществления трансфекции необходимо заставить клетки перейти в период G( клеточного цикла (Park et al., 2000). С целью расширения круга клеток-мишеней лентивирусный белок, кодируемый геном env, можно заменить путем псевдотипирования на G-белок вируса везикулярного стоматита или на другой подходящий белок (Li et al., 1998). Длительную экспрессию трансгенов, доставленных с помощью лентивирусного вектора, наблюдали в ЦНС экспериментальных животных. Стабильная и эффективная доставка трансгенов осуществлена также в клетки сетчатки.
Применение лентивирусных векторов почти не вызывает воспаления или других признаков поражения тканей.
Безопасность. Поскольку лентивирусные векторы получают на основе генома ВИЧ-1, особенную озабоченность вызывает риск рекомбинации, восстанавливающей способность к репродукции (Amado and Chen, 1999). Репродуцирующийся лентивирусный вектор теоретически опасен тем, что он может вызвать инсерционный мутагенез или приобрести свойства исходного ВИЧ-1. Не ясно также, к чему приведет заражение ВИЧ человека, которого ранее лечили с помощью лентивирусного вектора. Теоретически ВИЧ-инфекция может вызвать мобилизацию встроенного вектора, поскольку ВИЧ способен выступить в роли вируса-помощника. Кстати, это может быть использовано для генотерапии ВИЧ-инфекции с помощью лентивирусных векторов. Сомнения в безопасности должны быть устранены в ходе усовершенствования конструкции векторов и методов их получения.
Аденовирусы
Аденовирусы содержат линейную двухцепочечную ДНК и способны к репродукции независимо отделения клетки-хозяина. Аденовирусные векторы имеют ряд преимуществ, что стимулирует разработку их клинического применения. Они позволяют доставлять гены в различные ткани человека, в том числе в эпителий дыхательных путей, эндотелий, миокард и скелетные мышцы, клетки периферической и центральной нервной системы, гепатоциты, экзокринные клетки поджелудочной железы и различные типы опухолей. Известно более 40 серотипов аденовирусов человека, а вызываемые ими заболевания подробно описаны (Horwitz, 1990). Почти все взрослые люди перенесли аденовирусную инфекцию, и в их крови имеются антитела против аденовирусов.
Аденовирусные векторы обеспечивают эффективную трансфекцию как делящихся, так и неделящихся клеток с последующей экспрессией трансгенов. Можно использовать разные пути введения, например в/в, внутрибрюшинный, внутрипузырный, внутричерепной, интратекальный, а также инъекцию в желчные пути или непосредственно в паренхиму органа. Многообразие путей введения позволяет выбрать наилучший для выбранной мишени. Аденовирусные векторы имеют два существенных недостатка. Во-первых, после заражения клетки вирусный геном не встраивается в ДНК клетки, поэтому длительной экспрессии трансгена не происходит. Во-вторых, аденовирусная инфекция активирует как клеточное, так и гуморальное звенья иммунитета, что ведет к уничтожению трансфицированных клеток и снижает эффективность повторного введения вектора. Побочные эффекты аденовирусных векторов также объясняются иммунным ответом.
Жизненный цикл. Аденовирусная инфекция начинается со связывания нитей, выступающих на вершинах икосаэдрического капсида, с рецептором вирусов Коксаки и аденовирусов, расположенным на мембране клетки (рис. 5.2). Затем происходит взаимодействие последовательности из трех аминокислотных остатков (Apr— Гли—Асн), расположенной в основании вирусного пентона, с клеточными интегринами (avβ3- или аvβ5-интегрином), что приводит к эндоцитозу и интернализации вируса. Вирус покидает эндосому до ее слияния с лизосомой и таким образом избегает переваривания. Вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где начинается синтез вирусных мРНК, причем деления клетки для этого не требуется. В делящихся клетках при высоком уровне заражения иногда происходит встраивание вирусного генома в ДНК клетки, однако это достаточно редкое событие, существенно не влияющее на применимость аденовирусных векторов. Экспрессия и репликация вирусного генома проходят в определенной последовательности, которую во многом определяют гены Е1А и ЕIB, расположенные в 5'-области аденовирусного генома. Эти гены обеспечивают трансактивацию нескольких вирусных генов, расположенных дальше в З'-направлении (Horwitz, 1990).
Поскольку гены Е1 участвуют в репродукции аденовирусов, их удаление блокирует или, по крайней мере, существенно затрудняет репродукцию. Из-за более сложного строения вируса удалить из вектора все аденовирусные гены труднее, чем ретровирусные. Синтез аденовирусных белков после заражения клеток существующими аденовирусными векторами активирует клеточное и гуморальное звенья иммунитета. В некоторых случаях это может ограничивать использование вектора вследствие гибели трансфицированных клеток и низкой эффективности повторного введения вектора.
Конструкция и получение вектора. Из множества известных серотипов аденовирусов для получения векторов используют в основном серотипы 2 и 5. Аденовирусные векторы первого поколения были получены путем удаления Е1- и E3-районов из вирусного генома. После этих делеций вирус не способен к репродукции, а в геном можно включить до 7500 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. В аденовирусных векторах второго поколения удалены также Е2- и E4-районы, что способствует снижению иммуногенности, но снижает экспрессию трансгенов в зараженных клетках. В результате удаления еще большего числа вирусных генов получены аденовирусные векторы, зависящие от вирусов-помощников (Kochanek, 1999). В их состав можно включить больше чужеродной ДНК, и при их применении снижен риск иммунного ответа, однако такие векторы трудно сконцентрировать, и они менее стабильны in vivo.
Рисунок 5.2. Использование аденовирусного вектора. Рекомбинантный аденовирус связывается со специфическими рецепторами на поверхности клетки-мишени и проникает в нее путем эндоцитоза. Вирусные белки обеспечивают выход вируса из эндосомы до ее слияния с лизосомой; благодаря этому вирус избегает разрушения. Аденовирусная ДНК освобождается от белков и проникает в ядро, где начинается синтез новых мРНК. При этом аденовирусная ДНК, содержащая трансген, не встраивается в геном клетки-хозяина.
Аденовирусные векторы в большом количестве получают путем заражения упаковывающих клеток (обычно эмбриональных клеток почки человека, линии 293), экспрессирующих вирусный белок Е1, что компенсирует отсутствие соответствующего гена в рекомбинантном вирусе. Затем зараженные клетки лизируют, а лизат подвергают центрифугированию в градиенте плотности хлорида цезия. Этот метод позволяет не только очистить вирусы от других компонентов клеточной культуры, но и сконцентрировать его, получив более 1013 вирусов в 1 мл. Очищенный вирус очень устойчив в различных буферных растворах, а для длительного хранения может быть заморожен без потери активности.
Клетки-мишени. Аденовирусы заражают широкий круг делящихся и неделящихся клеток, поскольку рецепторы для вирусов Коксаки и аденовирусов имеются почти у всех клеток. Лишь у некоторых клеток этих рецепторов мало или они недоступны. Существуют способы изменения тропности аденовирусов (Wickham, 2000). Использование антител двойной специфичности к нитям вируса и мембранным белкам клетки позволяет блокировать естественную тропность вируса и перенаправить его на определенный тип клеток. Для изменения тропности или облегчения взаимодействия с клетками можно с помощью методов генной инженерии модифицировать вирусные нити или их концевые головки (Douglas et al., 1999). Наконец, можно использовать адаптерные белки, например химерный белок, содержащий последовательности эпидермального фактора роста и рецептора вирусов Коксаки и аденовирусов. Это облегчает связывание вируса с клетками, экспрессирующими рецептор эпидермального фактора роста (Dmitriev et al., 2000).
Применение. В настоящее время проводится много клинических испытаний, в которых аденовирусные векторы применяют для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. При лечении наследственных заболеваний большим недостатком является непродолжительность экспрессии трансгенов и иммунный ответ на зараженные клетки. Внехромосомная локализация аденовирусного генома в клетке ограничивает продолжительность экспрессии трансгенов в активно делящихся клетках (например, клетках костного мозга или эпителия), так как деление клеток не сопровождается репликацией трансгена. Аденовирусные векторы, как способные, так и не способные к репродукции, могут найти применение в лечении злокачественных новообразований (см. ниже).