Изменения
→Аденовирусы
== Лентивирусы ==
Вирусы, относящиеся к этому подсемейству ретровирусов, способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки (Buchschacher, Jr. and Wong-Staal,2000). Из лентивирусов лучше всего изучен ВИЧ-1, а векторы, полученные на его основе, теоретически обладают рядом преимуществ перед описанными ретровирусными векторами. Особенно многообещающей является их способность к высокоэффективной трансфекции трансдукции стволовых кроветворных клеток (Miyoshi et al., 1999). Эти векторы также могут обеспечить длительную экспрессию трансгена. Однако в силу происхождения лентивирусных векторов перед проведением клинических испытаний необходимо убедиться в их безопасности (Amado and Chen, 1999).
'''Жизненный цикл'''. Лентивирусы сходны с другими ретровирусами (Tang et al., 1999). Основное отличие, объясняющее способность лентивирусов заражать неделящиеся клетки, состоит в том, что вирусный преинтеграционный комплекс взаимодействует с ядерной оболочкой, а затем транспортируется через нее. Этот преинтеграционный комплекс состоит из вирусного генома (в виде ДНК), интегразы и белка матрикса, кодируемого геном gag. Белок матрикса содержит последовательность, обеспечивающую связывание вируса с порой ядерной оболочки. Последующий перенос внутрь ядра делает возможным интеграцию вирусного генома в ДНК неделящейся клетки.
'''Конструкция и получение вектора'''. Лентивирусные векторы лишены способности к репродукции благодаря удалению из генома ВИЧ-1 некоторых дополнительных генов, поэтому для их получения используют упаковывающие клетки, в которых независимые гены кодируют необходимые для сборки вируса компоненты (Srinivasakumar and Schuening, 1999). Это существенно снижает риск рекомбинации при получении вектора, в результате которой теоретически возможно восстановление способности вируса к репродукции. Удаление гена tat и длинных концевых повторов (LTR) также снижает риск восстановления способности к репродукции при получении вектора или in vivo.
'''Клетки-мишени'''. Лентивирусные векторы способны заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, например стволовые кроветворные клетки или специализированные клетки — мышечные, нейроны, гепатоциты, фоторецепторы сетчатки. Однако иногда для осуществления трансфекции трансдукции необходимо заставить клетки перейти в период G( клеточного цикла (Park et al., 2000). С целью расширения круга клеток-мишеней лентивирусный белок, кодируемый геном env, можно заменить путем псевдотипирования на G-белок вируса везикулярного стоматита или на другой подходящий белок (Li et al., 1998). Длительную экспрессию трансгенов, доставленных с помощью лентивирусного вектора, наблюдали в ЦНС экспериментальных животных. Стабильная и эффективная доставка трансгенов осуществлена также в клетки сетчатки.
'''Применение''' лентивирусных векторов почти не вызывает воспаления или других признаков поражения тканей.
Аденовирусы содержат линейную двухцепочечную ДНК и способны к репродукции независимо отделения клетки-хозяина. Аденовирусные векторы имеют ряд преимуществ, что стимулирует разработку их клинического применения. Они позволяют доставлять гены в различные ткани человека, в том числе в эпителий дыхательных путей, эндотелий, миокард и скелетные мышцы, клетки периферической и центральной нервной системы, гепатоциты, экзокринные клетки поджелудочной железы и различные типы опухолей. Известно более 40 серотипов аденовирусов человека, а вызываемые ими заболевания подробно описаны (Horwitz, 1990). Почти все взрослые люди перенесли аденовирусную инфекцию, и в их крови имеются антитела против аденовирусов.
Аденовирусные векторы обеспечивают эффективную трансфекцию трансдукцию как делящихся, так и неделящихся клеток с последующей экспрессией трансгенов. Можно использовать разные пути введения, например в/в, внутрибрюшинный, внутрипузырный, внутричерепной, интратекальный, а также инъекцию в желчные пути или непосредственно в паренхиму органа. Многообразие путей введения позволяет выбрать наилучший для выбранной мишени. Аденовирусные векторы имеют два существенных недостатка. Во-первых, после заражения клетки вирусный геном не встраивается в ДНК клетки, поэтому длительной экспрессии трансгена не происходит. Во-вторых, аденовирусная инфекция активирует как клеточное, так и гуморальное звенья иммунитета, что ведет к уничтожению трансфицированных клеток и снижает эффективность повторного введения вектора. Побочные эффекты аденовирусных векторов также объясняются иммунным ответом.
[[Image:Gud_5_2.jpg|300px|thumb|right|Рисунок 5.2. Использование аденовирусного вектора.]]
'''Жизненный цикл'''. Аденовирусная инфекция начинается со связывания нитей, выступающих на вершинах икосаэдрического капсида, с рецептором вирусов Коксаки и аденовирусов, расположенным на мембране клетки (рис. 5.2). Затем происходит взаимодействие последовательности из трех аминокислотных остатков (Apr— Гли—Асн), расположенной в основании вирусного пентона, с клеточными интегринами (avβ3- или аvβ5-интегрином), что приводит к эндоцитозу и интернализации вируса. Вирус покидает эндосому до ее слияния с лизосомой и таким образом избегает переваривания. Вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где начинается синтез вирусных мРНК, причем деления клетки для этого не требуется. В делящихся клетках при высоком уровне заражения иногда происходит встраивание вирусного генома в ДНК клетки, однако это достаточно редкое событие, существенно не влияющее на применимость аденовирусных векторов. Экспрессия и репликация вирусного генома проходят в определенной последовательности, которую во многом определяют гены Е1А и ЕIBE1B, расположенные в 5'-области аденовирусного генома. Эти гены обеспечивают трансактивацию нескольких вирусных генов, расположенных дальше в З'-направлении (Horwitz, 1990).
Поскольку гены Е1 участвуют в репродукции аденовирусов, их удаление блокирует или, по крайней мере, существенно затрудняет репродукцию. Из-за более сложного строения вируса удалить из вектора все аденовирусные гены труднее, чем ретровирусные. Синтез аденовирусных белков после заражения клеток существующими аденовирусными векторами активирует клеточное и гуморальное звенья иммунитета. В некоторых случаях это может ограничивать использование вектора вследствие гибели трансфицированных клеток и низкой эффективности повторного введения вектора.
'''Конструкция и получение вектора'''. Из множества известных серотипов аденовирусов для получения векторов используют в основном серотипы 2 и 5. Аденовирусные векторы первого поколения были получены путем удаления Е1- и E3-районов из вирусного генома. После этих делеций вирус не способен к репродукции, а в геном можно включить до 7500 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. В аденовирусных векторах второго поколения удалены также Е2- и E4-районы, что способствует снижению иммуногенности, но снижает экспрессию трансгенов в зараженных клетках. В результате удаления еще большего числа вирусных генов получены аденовирусные векторы, зависящие от вирусов-помощников (Kochanek, 1999). В их состав можно включить больше чужеродной ДНК, и при их применении снижен риск иммунного ответа, однако такие векторы трудно сконцентрировать, и они менее стабильны in vivo.
Аденовирусные векторы в большом количестве получают путем заражения упаковывающих клеток (обычно эмбриональных клеток почки человека, линии 293), экспрессирующих вирусный белок Е1, что компенсирует отсутствие соответствующего гена в рекомбинантном вирусе. Затем зараженные клетки лизируют, а лизат подвергают центрифугированию в градиенте плотности хлорида цезия. Этот метод позволяет не только очистить вирусы от других компонентов клеточной культуры, но и сконцентрировать его, получив более 1013 10^13 вирусов в 1 мл. Очищенный вирус очень устойчив в различных буферных растворах, а для длительного хранения может быть заморожен без потери активности.
'''Клетки-мишени'''. Аденовирусы заражают широкий круг делящихся и неделящихся клеток, поскольку рецепторы для вирусов Коксаки и аденовирусов имеются почти у всех клеток. Лишь у некоторых клеток этих рецепторов мало или они недоступны. Существуют способы изменения тропности аденовирусов (Wickham, 2000). Использование антител двойной специфичности к нитям вируса и мембранным белкам клетки позволяет блокировать естественную тропность вируса и перенаправить его на определенный тип клеток. Для изменения тропности или облегчения взаимодействия с клетками можно с помощью методов генной инженерии модифицировать вирусные нити или их концевые головки (Douglas et al., 1999). Наконец, можно использовать адаптерные белки, например химерный белок, содержащий последовательности эпидермального фактора роста и рецептора вирусов Коксаки и аденовирусов. Это облегчает связывание вируса с клетками, экспрессирующими рецептор эпидермального фактора роста (Dmitriev et al., 2000).
'''Применение'''. В настоящее время проводится много клинических испытаний, в которых аденовирусные векторы применяют для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. При лечении наследственных заболеваний большим недостатком является непродолжительность экспрессии трансгенов и иммунный ответ на зараженные клетки. Внехромосомная локализация аденовирусного генома в клетке ограничивает продолжительность экспрессии трансгенов в активно делящихся клетках (например, клетках костного мозга или эпителия), так как деление клеток не сопровождается репликацией трансгена. Аденовирусные векторы, как способные, так и не способные к репродукции, могут найти применение в лечении злокачественных новообразований (см. ниже).
'''Безопасность'''. Основное побочное действие аденовирусных векторов — иммунный ответ, направленный против зараженных клеток. Обсуждение безопасности аденовирусных векторов особенно стимулировала смерть одного больного во время клинических испытаний (Marshall, 1999). Имеются также сомнения, что в процессе получения вектора полностью исключено образование рекомбинантного вектора, способного к репродукции. Аденовирусные векторы, предназначенные для клинического использования, нуждаются в тщательной проверке. Аденоассоциированные вирусы. Эти маленькие, лишенные оболочки вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, обладают рядом свойств, необходимых хорошему вектору. Они непатогенны, обеспечивают эффективную и стабильную трансфекцию трансдукцию неделящихся клеток, а кроме того, позволяют исключить экспрессию вирусных белков в зараженных клетках. Основные недостатки аденоассо-циированных векторов — маленькая емкость и трудности в концентрировании. Начались клинические испытания аденоассоциированных векторов, и есть основания рассчитывать на их пригодность для генотерапии (Monahan and Samulski, 2000).
'''Жизненный цикл'''. Для репродукции аденоассоциированные вирусы нуждаются в генетической информации вируса-помощника. В жизненном цикле аденоассоциированных вирусов выделяют две фазы. Такой вирус заражает клетку, включается в клеточный геном и в отсутствие вируса-помощника (аденовируса) остается там продолжительное время в латентном состоянии. В присутствии аденовирусов начинается активная фаза, приводящая к репродукции аденоассоциированного вируса и лизису клеток. Геном аденоассоциированного вируса содержит две открытые рамки считывания (гер и cap), ограниченные инвертированными концевыми повторами (ITR). Для репродукции вируса нужны только гены гер, кодирующие четыре белка, которые обеспечивают репродукцию аденоассоциированного вируса, транскрипцию вирусной ДНК и эндонуклеазную активность, необходимую для встраивания в клеточный геном. Структурные белки, образующие капсид вируса, кодируются геном cap. В районе инвертированных концевых повторов находятся точки начала репликации; эти повторы содержат сигналы для сборки вирусов, а также участвуют во встраивании вирусной ДНК в клеточный геном. Функция многих белков и другие особенности биологии вируса стали известны после изучения природных немодифицированных вирусов (Kotin, 1994).
Заражение начинается с прикрепления вируса к его основному рецептору на клетке — протеогликану, содержащему гепарансульфат (Summerford and Samulski, 1998). В проникновении вируса в клетку участвуют также рецептор фактора роста фибробластов и сц,Р5-интегрин (Summerford et al., 1999). Интернализация вируса осуществляется путем эндоцитоза через образование покрытых клатрином окаймленных ямок (Bartlett et al., 2000а). Внутри клетки геном аденоассоциированного вируса замыкается в кольцо и образует кольцевые конкатемеры, находящиеся вне хромосом (Yang et al., 1999). Образование этих кольцевых форм вирусного генома сопровождается длительной экспрессией трансгена (Duan et al., 1998). Природный аденоассоциированный вирус может встраиваться в ДНК человека на одном участке 19-й хромосомы (19q 13.3—qter). Рекомбинантный вирус иногда утрачивает эту способность (Rivadeneira et al., 1998). Конструкция и получение вектора. Существующие аденоассоциированные векторы получают с помощью системы трех рекомбинантных плазмид (Xiao et al., 1998). Первая плазмида содержит трансген, расположенный между двумя инвертированными концевыми повторами, вторая — гены гер и cap, а третья — участки генома аденовируса, необходимые для сборки аденоассоциированного вируса. Этот подход позволяет обойтись без дополнительного заражения продуцирующих клеток аденовирусом. Из-за небольшого размера генома аденоассоциированных вирусов в вектор можно включить не более 5200 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Это не только ограничивает размер потенциального трансгена, но и затрудняет использование специальных промоторов и энхансеров, регулирующих его экспрессию в зараженной клетке. При использовании двухвекторной системы можно вдвое увеличить емкость вектора: две половины трансгена соединяются in vivo из двух разных векторов, которые объединяются в кольцевой конкатемер внутри клетки (Sun et al., 2000; Yan et al., 2000). Таким же образом можно собирать большие гены или включать важные регуляторные элементы, слишком большие для одного вектора (Duan et al., 2000). В настоящее время основные проблемы в использовании аденоассоциированных векторов связаны с трудностями получения высокой концентрации вектора и определения его титра. Клетки-мишени. Аденоассоциированные векторы способны заражать различные клетки. В доклинических исследованиях показана эффективная трансфекция трансдукция клеток скелетных мышц, ЦНС, легких, печени, ЖКТ и глаза.
'''Применение'''. Аденоассоциированные векторы начали применять в клинике: сейчас проводятся клинические испытания доставки генов в легкие и в скелетные мышцы. По-видимому, эти векторы подходят для обеспечения длительной экспрессии трансгенов в скелетных мышцах, сердце, ЦНС и других тканях. Первые результаты клинического испытания, в котором с помощью аденоассоциированного вектора осуществляли доставку гена фактора IX в скелетные мышцы больных гемофилией, оказались успешными (см. ниже). Способность этих векторов обеспечивать длительную экспрессию трансгенов, не оказывая токсического действия на клетки и не вызывая иммунного ответа, делает их перспективным инструментом лечения некоторых наследственных заболеваний.