Источник:
Эндокриная система, спорт и двигательная активность.
Перевод с англ./под ред. У.Дж. Кремера и А.Д. Рогола. - Э64
Издательство: Олимп. литература, 2008 год.
Содержание
Качественный анализ при проведении допинг-контроля
Для большинства запрещенных субстанций в профессиональном спорте для позитивного результата теста достаточно просто получить подтверждение их присутствия в образце мочи. Поскольку многие методы скрининга и получения доказательств основаны на применении хроматографии в сочетании с масс-спектроскопией, были разработаны рекомендации для идентификации химических соединений с помощью систем ГХ-МС и ЖХ-МС(/МС). Присутствие вещества считается подтвержденным, если по относительной представленности определенного количества характерных ионов (в зависимости от применяемой разновидности масс-спектрометрии) образец сопоставим, с учетом допустимых отклонений, с соответствующим образцом стандарта, подвергнутым аналогичному анализу. Кроме того, время удержания вещества не должно отличаться (в пределах допустимого интервала отклонения) при хроматографическом анализе образца мочи спортсмена и контрольного образца мочи, содержащей искомое вещество. Поэтому для характеристики и идентификации веществ в столь сложных для анализа образцах, как пробы мочи, определяющее значение имеет информация о хроматографических и, особенно, масс-спектрометрических параметрах исследуемых химических соединений. К настоящему времени проведены многочисленные исследования масс-спектрометрических характеристик стимулирующих или маскирующих препаратов, а также разработаны методы их детекции с целью проведения допинг-контроля (Masse et al., 1989; de Boer et al., 1991; Donike et al., 1995; Ayotte et al., 1996; Shackleton et al., 1997; Bowers, 1998; Aguilera et al., 1999; Thevis et al., 2000, 2001, 2002, 2003a).
Далее рассмотрим общие принципы проведения анализа некоторых из этих веществ.
Анаболические стероиды
Рассматривая статистические данные в отношении результатов проведенных тестов на допинг и классов выявленных запрещенных веществ, можно заметить, что наиболее часто в качестве допинга в спорте применяют анаболические стероиды. Например, более 40 % запрещенных субстанций, обнаруженных аккредитоваными МОК лабораториями в 2001 г., были анаболическими стероидами. Одним из представителей этой группы является метилтестостерон — производное тестостерона, получаемое путем замены метальной группой остатка водорода у С-17. Анаболические стероиды в большинстве своем активно вовлекаются в метаболические процессы, образуя в результате серию метаболитов, например восстановление кетогрупп, окисление гидроксильных групп, гидроксилирование, а также окисление/восстановление связей углерод—углерод в ядре молекулы стероида (Schanzer, 1996). Вслед за этой фазой I метаболизма и перед выделением в составе мочи происходит фаза II метаболизма, а именно конъюгация продуктов фазы I с глюкуропидами или сульфатами.
Общепринятые стратегии идентификации метаболитов анаболических стероидов основываются на ферментативном гидролизе метаболитов фазы II, в ходе которого образуются метаболиты фазы I, их очистка, концентрация, дериватизация и последующий анализ ГХ-МС. Большинство метаболитов анаболических стероидов, за исключением нандролона, о котором речь пойдет ниже, не способны образовываться в организме человека естественным путем, поэтому в случае обнаружения этих соединений в моче спортсмена, подвергнутого допинг-контролю, будет сделано сообщение о положительном результате теста.
Сконструированные стероиды
Проблема применения так называемых сконструированных стероидов (designer steroid) в спорте и в научном мире нарастает подобно снежной лавине после того, как в октябре 2003 г. (Knight, 2003) лаборатория допинг-контроля Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе обнаружила вещество, производное гестринона — лекарственного препарата, применяемого для лечения эндометриоза. Гидрогенирование этинилового остатка, расположенного у 17 углерода этого соединения, приводит к образованию стероидного гормона тетрагидрогестринона (THG), который может рассматриваться как аналог высокоэффективного анаболического стероида тренболона, однако клинические исследования физиологического воздействия и побочных эффектов THG никогда не проводились. Общепринятых в исследовательских лабораториях стратегий допинг-контроля, которые до сих пор были направлены на обнаружение прошедших клинические испытания фармацевтических препаратов, оказывается явно недостаточно для преодоления стремления некоторых спортсменов одержать победу пал соперниками обманным путем, подвергая при этом риску собственное здоровье. Учитывая тот факт, что многие процедуры скрининга основаны на сравнении стандартных образцов с пробами мочи с применением таких методик масс-спектрометрии, как мониторинг заданных ионов (selected ion monitoring, SIM) или мониторинг множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM), неизвестные производные или лекарственные препараты, такие, как THG, являются "невидимыми* для стандартных процедур контроля. Это обусловливает необходимость разработки более гибких методик контроля, которые бы позволяли детектировать как известные, так и неизвестные вещества, обладающие сходной структурой, например общее стероидное ядро, что в принципе возможно, в частности, с применением современных систем ГХ-МС/МС.
Эндогенные стероиды
Если в случае применения анаболических стероидов в моче появляются метаболиты, которые не наблюдаются в норме, применение тестостерона как допинга обнаружить гораздо сложнее, поскольку этот гормон вырабатывается в организме человека. Для этой цели были разработаны различные подходы, наиболее распространенными из которых являются определение соотношения тестостерон/эпитестостерон (Т/Э) и так называемое масс-спектрометрическое измерение соотношения стабильных изотопов углерода (IRMS). Профиль эндогенных стероидов может варьировать в различных ситуациях (Geyer et al., 1996), однако было показано, что соотношение Т/Э является достоверным показателем применения тестостерона как допинга, поскольку продукция эпитестостеропа происходит независимо от тестостерона. В качестве порогового принято значение соотношения Т/Э, равное 6, однако в случае превышения порога позитивный результат теста регистрируется не сразу, спортсмен должен пройти дальнейшее исследование, направленное на контроль естественного повышенного уровня тестостерона.
Увеличение доступности изотопного анализа методом масс-спектрометрии (IRMS) способствовало проведению ряда исследований, показавших возможность обнаружения различий между эндогенным и синтетическим тестостероном с помощью данного подхода. В частности, было установлено, что природный тестостерон отличается от синтезированных химическим путем аналогов, которые используются как медицинские препараты по соотношению изотопов углерода ,3С/,2С. Применение ГХ с последующим сжиганием анализируемого вещества и анализом образовавшегося при этом диоксида углерода позволяет получать информацию о происхождении тестостерона на основании данных о соотношении изотопов |3С и ,JC (Homing et al., 1998; Aguilera et al., 1999).
Диуретики и бета2-агонисты
К веществам, анализ которых обычно производится посредством ГХ-МС(/МС), относятся также диуретики и β2-агонисты. В частности, группа диуретиков характеризуется химическим разнообразием препаратов, назначаемых для сходных или идентичных целей. Для представителей этой группы веществ применяют преимущественно негативную ионизацию (Thieme et al., 2001; Thevis et al., 2002, 2003a), что обусловлено их кислотными свойствами, однако для некоторых диуретиков, в частности триамтерена, требуется позитивная ионизация. Для β2-агонистов основным подходом является протопирование анализируемого вещества с последующей детекцией позитивно заряженной молекулы. Как описано в "Методы анализа”, источники ионов, сопрягающие ГХ с МС, обычно позволяют генерировать протонированные или депротонированные молекулы без заметной их фрагментации. Таким образом, структурная информация об анализируемых веществах, специфичность и избирательность масс-анализаторов обеспечиваются применением индуцированной столкновениями диссоциации (CAD) ионизированных препаратов и последующим анализом производных фрагментов. Для этого необходимо иметь сведения про сродство к протонам и поведение продуктов диссоциации после эффективной активации анализируемых молекул с помощью CAD, которая существенно отличается по механизмам фрагментации молекул от электронного удара (EI). Для диуретиков, а также для основной массы β2-агонистов, за исключением салбутамола достаточно проведение качественного анализа. Обычно хроматограммы экстрагированных ионов делают возможной достаточно чувствительную детекцию этих веществ в биологических пробах, а положительный вывод об их наличии делается па основании существенного численного преобладания их результирующих ионов. В 2001 г. около 17,5 % случаев положительных результатов проведенного в 25 аккредитованных МОК лабораториях допинг-контроля относились к применению β2-агонистов, диуретики были обнаружены в 5 % случаев.
Допинг-контроль: количественный анализ
Для некоторых субстанций, включая стимуляторы, такие, как эфедрин, метаболиты анаболических стероидов, такие, как нандролон, и β2-агонисты, такие, как салбутамол, установлен пороговый уровень, на основании сравнения с которым делается вывод о положительных или отрицательных результатах теста. Основанием для такого решения стали различные причины. Эфедрины входят в состав многих противопростудных лекарственных препаратов, поэтому по антидопинговым правилам их применение является законным, если содержание производных норэфедрина, эфедрина и псевдоэфедрина в моче не превышает 5, 10 или 25 мг-мл'1 соответственно. Салбутамол относится к группе симпатомиметиков, является одним из 4 разрешенных для использования β2-агонистов (наряду с салметеролом, тербуталином и формотеролом) при условии их применения в виде ингаляции. Поскольку определить, как применялся препарат (орально в виде таблеток или в виде аэрозоля) и в какой дозировке, достаточно сложно, о присутствии салбутамола в пробах во время соревнований сообщают в соответствующую федерацию; если содержание вещества превышает 100 нг-мл'1. В период между соревнованиями установлен пороговый уровень 1 мг-мл"1, поскольку при использовании некоторых симпатомиметиков в дозах, существенно превышающих терапевтические, наблюдаются анаболические эффекты. Присутствие метаболита нандролона 5а-эстраи-За-ол-17-один (норандростерона) в моче профессиональных спортсменов может быть в определенной степени обусловлено эндогенной продукцией, поэтому для этого вещества установлено пороговое содержание 2 иг-мл*1 для мужчин и 5 нг-мл'1 для женщин. Для обоснования полученных значений были проведены многочисленные исследования, также были учтены различные факторы, которые могут влиять на уровень эндогенного образования этого метаболита, например значительный физиологический стресс или беременность, которые приводят к существенному повышению содержания этого вещества в моче. Количественное определение этих соединений осуществляется с использованием калибровочных кривых, которые строят на основании результатов определения стандартными методами соответствующих внутренних стандартов, обладающих сходными или идентичными физико-химическими свойствами (Schanzer, Donike, 1995).
Заключение
При проведении допинг-контроля анализ низкомолекулярных соединений основан преимущественно на применении хроматографических и масс-спектрометрических методов, которые делают возможным обнаружение и идентификацию запрещенных препаратов и их метаболитов в пробах биологических жидкостей, таких, как кровь и моча. В то время как в прежние годы анализ проводился главным образом газовой хроматографией с детекцией разделенных продуктов различными анализаторами, например пламенно-ионизационными и азотно-фосфорными детекторами, а также масс-спектрометрическими анализаторами. В последних работах применяется в основном жидкостная хроматография, продукты разделения которой после ионизации при атмосферном давлении подвергаются масс-спектрометрическому анализу, поскольку данный подход позволяет существенно сократить время подготовки образцов и не требует дериватизации анализируемых веществ. Кроме того, благодаря применению тройных квадрупольных анализаторов и ионных ловушек стало возможным осуществление более гибких масс-спектрометрических экспериментов, направленных на определение и характеристику известных лекарственных препаратов, а также неизвестных сконструированных веществ, что также способствует усилению борьбы против допинга и нелегального применения запрещенных препаратов. С момента создания списка запрещенных субстанций и методов стимуляции диапазон веществ, которым уделяется внимание при проведении допинг-контроля, пе перестает изменяться и лабораториям в рамках этого динамического процесса приходится постоянно расширять и модифицировать методы анализа, повышая их чувствительность, специфичность и приспособляемость к решению новых задач, чтобы ограничить злоупотребления лекарственными препаратами в спорте, а также уберечь спортсменов от ложных подозрений. И здесь новые разработки в области высокоскоростной и высокоэффективной хроматографии, масс-спектрометрических, обладающих высоким разрешением и чувствительностью, а также современных приемов ионизации предоставляют аналитическим лабораториям ценные инструменты, которые позволяют получать еще более подробную информацию о примененных веществах, например об их структуре и метаболизме, и расширить временные рамки выявления злоупотреблений стимулирующими препаратами. Поскольку многие препараты, такие, как анаболические стероиды, применяются в период между соревнованиями, но при этом сохраняют свой стимулирующий эффект на протяжении нескольких недель, для полноценного допинг-контроля необходимо проведение анализов как во время соревнований, так и во внесоревновательном периоде. Кроме того, требуется максимальная специфичность и чувствительность аналитических процедур.