'''Эритропоэтин''' представляет собой гликопротеиновый — чрезвычайно активный гормон, точнее цитокин, основной регулятор оказывающий свое действие в организме в пикомолярных концентрациях. Небольшие колебания его концентрации в крови приводят к существенным изменениям скорости эритропоэза, который стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга в зависимости а нормальный диапазон его концентраций колеблется от потребления кислородадо 4 до 26 МЕ/л. До тех пор Поэтому пока концентрация гемоглобина не нарушена оксигенация тканейстанет ниже 105 г/л, концентрация эритропоэтина, так же, как не выходит за указанный диапазон и количество циркулирующих эритроцитов, остается постояннойвыявить ее повышение невозможно (если только не знать ее исходные значения). Выработка Эритроцитоз приводит к подавлению выработки эритропоэтина регулируется на уровне транскрипции его гена, а поскольку единственным физиологическим стимулом, увеличивающим! количество синтезирующих эритропоэтин клеток, является гипоксия, ни выработка, ни метаболизм эритропоэтина от его концентрации в плазме по механизму отрицательной обратной связи. Это обусловлено не зависят. В организме здорового человека находится примерно 2,3только повышением доставки кислорода к тканям из-1013 за увеличения числа циркулирующих эритроцитов, время жизни которых составляет в среднем 120 днейно и увеличением вязкости крови. Следовательно, в организме постоянно должно происходить обновление пула Для спортсмена это означает снижение продукции собственного гормона при введении экзогенного и нарушение механизмов регуляции выработки эритроцитов со скоростью примерно 2,3 млн клеток за одну секунду. Система дифференцировки эритроидных клеток должна строго регулироваться для поддержания постоянного уровня циркулирующих эритроцитов при нормальных условиях. Кроме тогоПоэтому, эта система должна быть высоко чувствительна к изменению количества кислорода используя эритропоэтин в спорте в качестве [[допинг в организме. В настоящее время получено множество данныхспорте|допинга]], свидетельствующих спортсмену следует задуматься о том, что ключевым фактором, который обеспечивает контроль дифференцировки клеток эритроидного ряда, является циркулирующий дальнейшей судьбе продукции эритроцитов в крови эритропоэтинсвоем организме.

Эритропоэтин — чрезвычайно активный гормон=== Допинг тесты === Как правило, оказывающий свое действие эритропоэтин выявляется в организме в пикомолярных концентрацияхобразцах мочи или крови. Небольшие колебания его концентрации в В крови приводят к существенным изменениям скорости эритропоэзавыявляется с большей вероятностью, а нормальный диапазон его концентраций колеблется от до 4 до 26 МЕчем в моче. Период полувыведения составляет 5-л"1. Поэтому пока концентрация гемоглобина не станет ниже 105 гл~'9 часов, концентрация эритропоэтина не выходит за указанный диапазон и выявить ее повышение невозможно (если только не знать ее исходные значения)то есть вероятность обнаружения существенно снижается уже через 2-3 суток. Эритроцитоз приводит к подавлению выработки эритропоэтина по механизму отрицательной обратной связи В качестве маскирующего агента применяется гепарин<ref>https://www. Это обусловлено не только повышением доставки кислорода к тканям изwada-за увеличения числа циркулирующих эритроцитов, но и увеличением вязкости кровиama. Для спортсмена это означает снижение продукции собственного гормона при введении экзогенного и нарушение механизмов регуляции выработки эритроцитовorg/en/resources/science-medicine/heparin-more-than-a-masking-agent-in-epo-doping-control</ref>. Поэтому эритропоэтин Также используют введение протеаз в спорте часто используя в качестве [[допинг в спорте|допинга]] спортсмену следует задуматься о дальнейшей судьбе продукции эритроцитов в своем организмемочевой пузырь через катетер.<ref>http://www.cyclingnews.com/news/anti-doping-labs-seek-test-for-epo-masking-agent/</ref>

Долгое время вопрос о клетках, в норме продуцирующих эритропоэтинаэритропоэтин, оставался открытым. Это было связано прежде всего с отсутствием прямых методов идентификации клеток, синтезирующих гормон. Идентификацию клеток проводили косвенными методами, включая способность тех или иных культур тканей синтезировать продукт in vitro. Считалось, что основными кандидатами на роль ЭПО-продуцирующих клеток являются клубочковые клетки, а также клетки проксимальной части канальцев. Клонирование гена эритропоэтина, а также разработка методов гибридизации in situ, позволяющая идентифицировать непосредственно те клетки, в которых происходит экспрессия тех или иных генов, изменило представления о природе клеток, синтезирующих эритропоэтин. Методом гибридизации in situ было показано, что клетки, в которых синтезируется мРНК эритропоэтина, не являются гломерулярными или тубулярными. По-видимому, основным местом синтеза ЭПО в почках являются интерстициальные клетки или капиллярные эндотелиальные клетки. Как уже отмечалось, главным фактором, регулирующим продукцию ЭПО, является гипоксия. В условиях гипоксии количество циркулирующего в плазме ЭПО возрастает примерно в 1000 раз и достигает 5—30 ЕД-/мл"1. В многочисленных экспериментах с изолированной почкой показано, что она содержит сенсоры, реагирующие на изменения концентрации кислорода.

В лаборатории S. Копгу Konry в 1989 г. исследовали процесс индукции синтеза ЭПО с помощью метода, гибридизации in situ на тканевых срезах коркового вещества почки. Было обнаружено, что в условиях анемии продукция ЭПО значительно возрастает, хотя интенсивность гибридизации с мРНК ЭПО в индивидуальных клетках остается без изменений. Показано, что усиление продукции ЭПО связано с увеличением числа клеток, синтезирующих гормон. По мере восстановления нормального гематокрита количество эритропоэтин-синтезирующих клеток быстро уменьшается, причем кинетика изменения коррелирует с кинетикой снижения количества мРНК ЭПО и циркулирующего гормона. Данные гистологического анализа свидетельствуют о том, что ЭПО синтезируется интерстициальными клетками корковой части почки.

Синтез эритропоэтина в организме опосредован значительным количеством биохимических кофакторов и стимуляторов. Предполагается, что гипоксия приводит к снижению уровня кислорода в специфических сенсорных клетках почки, что вызывает усиление продукции простагландинов в клубочковых клетках. Показано, что простагландины играют важную роль в стимуляции продукции эритропоэтина. Ингибиторы синтеза простагландинов оказывают подавляющий эффект на продукцию ЭПО при гипоксии. Основной вклад в биосинтез простагландинов при гипоксии вносит, по-видимому, циклооксигеназная система. При гипоксии (а также при введении ионов кобальта) происходит высвобождение нейтральных протеаз и ли-зосомных лизосомных гидролаз в почках, которые, как было показано, также стимулируют продукцию ЭПО. Высвобождение лизосомальных ферментов, по-видимому, ассоциировано с увеличением продукции цГМФ. Показано, что лизосомальные ферменты активируются при участии протеинкиназ, которые, в свою очередь, активируются цАМФ.

При гипоксии наблюдается индукция активности фосфолипазы А2, что приводит к возрастанию уровня арахидонатов, которые при участии циклооксигеназы превращаются в эндоперокси-дыэндопероксиды. Отмечено, что гипоксия является оптимальным условием для активности циклооксигеназы. Вероятно, важную роль в этих биохимических событиях играет кальциевая система: ионы кальция стимулируют активность фосфолипазы А, и образование простагландина. Простаноиды, в свою очередь, могут индуцировать активность адени-латциклазы аденилатциклазы и запускать каскад биохимических событий, приводящих к фосфорилированию и активации гидролаз. Какова роль гидролаз и какова цепочка, приводящая в конце концов к усилению синтеза ЭПО, остается пока невыясненным. Стимулирующей биосинтез ЭПО активностью обладают также некоторые гормоны гипоталамо-гипофизарной системы, тиреоидные гормоны и некоторые стероидные гормоны. Специфическим индуктором продукции ЭПО являются ионы кобальта, механизм действия которых на систему биосинтеза ЭПО пока не ясен. Эта система является привлекательной экспериментальной моделью для изучения индукции биосинтеза ЭПО.

Молекула эритропоэтина человека, в которой на долю углеводного компонента приходится 40—50 % молекулярной массы (молекулярная масса гликопро-теида гликопротеида 32—36-Ю3 *10^3 а. е. м., а расчетная молекулярная масса белковой части — 18 399-103 *10^3 а. е. м.), состоит из 193 остатков аминокислот. Величина изоэлектрической точки ЭПО низкая (рН 3,5—4,0), что обусловлено наличием сиаловых кислот в терминальных положениях углеводных цепочек эритро-поэтинаэритропоэтина. Изоэлектрическая фокусировка плазменного ЭПО в полиакриамидном геле позволяет выявить несколько фракций, идентичных по молекулярной массе, но различающихся по величине их изоэлектрических точек, что свидетельствует о гетерогенности в структруре углеводной части гормона. Отщепление сиаловых кислот при обработке нейраминидазой или при кислотном гидролизе приводит к потере стабильности гормона in vivo, но не влияет на его активность in vitro. В

Ген эритропоэтина (Gene: [07q21/EPO] erythropoietin) состоит из пяти экзонов и четырех интронов. Ген кодирует белок, состоящий из 193 аминокислотных остатков. Идентифицированы четыре вида РНК, участвующих во взаимодействии с геном эритропоэтина, причем два вида представлены в экстракттах экстрактах после введения хлорида кобальта значительно меньшим числом копий, чем в нормальных экстрактах. Эти данные указывают на наличие негативных регуляторных факторов (вероятно, рибонуклеопротеидов), участвующих в регуляции экспрессии гена эритропоэтина. Предположение о негативной регуляции экспрессии гена ЭПО было подтверждено Semenza G. и сотрудниками в 1990 г., которые получили серию трансгенных мышей, несущих кодирующую часть гена ЭПО человека и различные фрагменты 5S-фланкирующей области. Анализ экспрессии гена у различных трансгенов позволил идентифицировать три регуляторных элемента гена эритропоэтина человека:

Было экспериментально показано, что существуют два участка инициации транскрипции гена эритропоэтина, несущих множество сайтов инициации. При нормальных условиях инициация трансу крипции транскрипции происходит с ограниченного числа сайтов, расположенных на обоих участках. При индукции анемии или обработке хлоридом кобальта количество функционирующих сайтов инициации транскрипции на обоих участках возрастает. Во всех случаях получение эритропоэтина ограничивается трудностями, связанными с выделением и культивированием клеток, нестабильностью продукции гормона и, наконец, низкой концентрацией его в культуральных жидкостях.

Принципиально иной подход к получению больших количеств высокоочищенного ЭПО был связан с применением методов генной и клеточной инженерии. Была сделана попытка создания бактериального продуцента эритропоэтина. Продуцируемый в Escherichia coli белок узнается антителами против ЭПО и имеет молекулярную массу, примерно соответствующую дегликозилированному ЭПО человека. Известно, что бактериальные клетки имеют систему гликозилирования, принципиально отличающуюся от эукариотической. Поэтому получить корректно гликозилированный белок в бактериальных клетках невозможно. В случае ЭПО получение корректно гликозилиро-ванного гликозилированного гликопротеина имеет принципиальное значение. Следовательно, создание продуцента гормона на основе бактериальных клеток является нецелесообразным. Эффективный продуцент биологически активного как in vitro, так и in vivo эритропоэтин может быть получен только на основе клеток высших животных.

При исследовании свойств рекомбинантно-го рекомбинантного ЭПО было показано, что наличие неполного углеводного компонента (молекулярная масса эритропоэтина, синтезированного в этой системе равна 23-103 *10^3 а. е. м.) не влияет на активность гормона in vitro, но значительно снижает его активность in vivo. В то же время полное отщепление углеводной части с помощью гликозидаз приводит к 80 %-ной потере биологической активности гормона в тесте in vitro. Эти данные находятся в противоречии с существующими представлениями о том, что углеводный компонент ЭПО не является строго необходимым для его активности in vitro.

К середине 1980-х годов, путем внедрения человеческого гена ЭПО (локализованного у человека на седьмой хромосоме в области llq11q-12q) в овариальные клетки хомячков, был получен первый рекомбинантный эритропоэтин. Рекомбинантный р-ЭПО человека, полученный методом генной инженерии (рекормон), идентичен по аминокислотному составу естественному ЭПО человека. Рекормон обеспечивает гибкий и экономичный метод эффективного лечения анемии в сочетании с высоким профилем безопасности и отличной переносимостью. Благодаря использованию рекормона значительно сокращается необходимость в проведении гемотрансфузий, которые на сегодняшний день являются наиболее распространенным методом коррекции анемии. Так, согласно многочисленным исследованиям, использование рекормона позволяет восстанавливать нормальный уровень гемоглобина и исключать необходимость в заместительных гемотрансфузиях у онкологических больных, страдающих анемией. При этом наблюдается значительное улучшение качества жизни этих больных; значительно снижается риск заражения, который существует при коррекции анемии с помощью гемотрансфузий в процессе лечения вирусных инфекционных заболеваний, таких, как ВИЧ и гепатит С. Рекормон выпускается в виде удобного устройства для введения и индикации препарата (шприц-ручка).

Вместе с тем имеются незначительные отличия по составу гликозидных остатков, которые влияют на физико-химические свойства всей молекулы гормона. Так, например, обнаружены определенные отличия в распределении электрического заряда для отдельных типов эритропоэтина. Препараты эритропоэтина производятся различными фармацевтическими фирмами в пяти видах: аальфа, Рбета, ретард (NESP), 8 тета и оомега).

С 1988 г. используются аальфа-ЭПО и (3бета-ЭПО. При подкожном введении их биодоступность составляет около 25 %, максимальная концентрация в крови — через 12—18 ч, период полувыведения — до 24 ч (при внутривенном введении — 5—6 ч). Эритропоэтин-ретард (NESP) используется в течение последних нескольких лет, действует дольше, чем другие препараты ЭПО. бТета-ЭПО на сегодня считается наиболее эффективным и наименее аллергенным, имеет наивысшую степень чистоты. Это связано с тем, что его получают методами генной инженерии в клетках человека (некоторые недобросовестные спортсмены и спортивные врачи считают, что это делает его неопределяемым). На самом деле, 5тета-ЭПО только на 99 % идентичен человеческому. соОмега-ЭПО, который получают из почек хомяков, больше всех других препаратов ЭПО отличается от человеческого, поэтому он наиболее прост для выявления. Продается только в странах Восточной Европы и Южной Америки.

Другое исследование заключалось в сравнении 11 препаратов ЭПО (полученных от восьми производителей), представленных на рынках вне ЕС и США, по содержанию, силе действия и изоформному составу действующего вещества (эритропоэтин). Биоактивность in vitro колебалась в пределах 71—226 %, при этом показатели 5 образцов не соответствовали спецификациям. Среди отклонений в изоформном составе названы: присутствие одной или более дополнительных кислых и(или) основных изоформ, а также измененное количественное соотношение различных изоформ. Были выявлены также межсерийные отличия; некоторые продукты не соответствовали собственным спецификациям, т. е. производители не обеспечивали адекватного контроля производственных процессов. Количество действующего вещества также не всегда соответствовало заявленному. Такие отклонения от заявленных параметров могут

История использования рекомбинантного эритропоэтина в спорте (общепринятые в научной литературе аббревиатуры гНиЕРОrHuEPO, гr-НиЕРОHuEPO, rhu-EPO, гЕРОrEPO) началась в 1977 г., когда впервые эритропоэтин в очищенном виде выделен из мочи человека. Внедрение и борьба с эритропоэтина в спорте и соревнованиях как запрещенного препарата прошло по следующим этапам:

*1989 г. — FDA (Food and Drug Administration — государственный орган США, контролирующий производство и распространение лекарств в стране) разрешает производство рекомбинантного ЭПО;

В настоящее время практически невозможна достоверная идентификация случаев экзогенного введения эритропоэтина в организм. Поэтому для контро ля контроля используются изменения физиологических параметров крови, которые обнаруживаются после введения ЭПО. Так, Международный союз велосипедистов использует критерий максимального значения гематокрита (50 % для мужчин). Международная федерация лыжного спорта в качестве такого критерия установила максимально допустимые значения гемоглобина (165 г /л-1 для женщин и 18,5 гл-1 185 г/л для мужчин), а также уровня ретикулоцитов не более 0,2 %. В случае превышения указанных предельных величин, установленные при проведении контрольной процедуры до соревнований, соответствующий спортсмен отстраняется от участия в соревнованиях в целях защиты здоровья. Однако и гемоглобин, и гематокрит -это показатели, на которые оказывают воздействие многие факторы. В частности, оба этих показателя могут существенно изменяться даже после одного занятия на выносливость среднего объема. Кроме того, эти показатели характеризуются значительной индивидуальной вариабельностью. Поэтому одно только превышение величины гематокрита более 50 % не может служить доказательством факта злоупотребления эритропоэтином в спорте.

Для улучшения контроля за использованием препаратов эритропоэтина в качестве допинга WADA ввело модус ведения паспорта крови спортсмена. Паспорт крови — одна из разработок WADA, напраИ ленная направленная прежде всего на выявление эритропоэтина и его аналогов. С ее помощью по 30 различным показателям формируется единый компьютерный гематологический профиль каждого спортсмена, для начала — в тех видах спорта, где необходима выносливость. К внедрению и доработке программы паспортизации крови присоединились уже 10 стран, в том числе Швеция, Норвегия, США, Канада и Германия. Российское антидопинговое агентство эту инициативу одобряет, но внедрить ее собирается после окончательной доработки всех медицинских и юридических аспектов.

== Читайе Читайте также ==