Редактирование: Количественное определение белка в продуктах

== Разработка методики количественного определения суммы аминокислот в шроте яблок ==

Нами изучена возможность использования нингидриновой реакции в количественном анализе суммы свободных а-[[Аминокислоты|аминокислот]] в шроте яблок. Кроме того, нами проведена оптимизация и оценка количественного содержания    а-аминокислот в сырье после кислотного гидролиза.

Приготовление образца 1. 10,0 г сырья (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния шестикратно экстрагируют горячей водой по 1 ч при температуре 80-90 °С (гидромодуль 1:8). Полученные извлечения фильтруют, объединяют, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят водой до метки (далее - исходное извлечение или образец 1).

С целью изучения влияния балластных веществ на количественное содержание суммы а-аминокислот в шроте яблок, нами приготовлено водное извлечение, очищенное от балластных веществ (образец 2).

Образец 2. К 20 мл исходного извлечения (образца 1) добавляют трехкратный объем 96 % этанола для осаждения балластных ВМС и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Нами установлено, что продукты взаимодействия обоих образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина характеризуются высокой стабильностью во времени: за период 1-1,5 ч после начала реакции их интенсивность светопоглощения при длине волны 400 нм снижается на 0,2-0,5 %.

Нами установлено, что из всех изученных а-аминокислот продукт взаимодействия пролина с нингидрином при длине волны 400 нм характеризуется наибольшей стабильностью (за период 1—1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,2 %). На этом основании мы установили предельные концентрации пролина в нингидриновой реакции, подчиняющиеся закону светопоглощения, а именно 0,016-0,072 мг/мл (рис 17).
[[Image:Ningidr17.jpg|250px|thumb|right|Рис 17. Калибровочный график продукта реакции пролина]]

На этом основании и с учетом ранее оптимизированных условий реакции с водным раствором нингидрина нами разработана методика проведения количественного определения а-аминокислот в шроте яблок.

К 1,5 мл исследуемых извлечений (образцы 1 и 2) добавляют 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения отбирают по 2 мл каждого из продуктов реакции и разбавляют их водой: до 10 мл (образец 1) и до 5 мл (образец 2) и спустя 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Параллельно проводят реакцию 1,5 мл свежеприготовленного 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 1,7 мл 0,2 % водного раствора нингидрина, после охлаждения отбирают 2 мл продукта реакции, разбавляют его водой до 5 мл и определяют оптическую плотность в аналогичных условиях. Стандартный образец пролина получен многократной дробной кристаллизацией пролина из этанольно-эфирной смеси.

Содержание суммы аминокислот в образцах относительно пролина вычисляют по формуле:

Х=[Dx*mo*100*a*100%]/[Do*mx*(100-W)*b]

Dx - оптическая плотность продуктов реакции исследуемых образцов с 0,2 % водным раствором нингидрина;

Do - оптическая плотность продукта реакции 0,017 % раствора стандартного образца пролина с 0,2 % водным раствором нингидрина;

mо и mх- средние массы навесок стандартного образца пролина и шрота яблок, соответственно, г,

W- остаточная влажность шрота яблок (14,9 %);

а и b - разведения продуктов нингидриновой реакции исследуемых образцов и стандартного образца пролина, соответственно, мл.

На основании проведённых для каждого образца шести параллельных испытаний получены результаты, которые приведены в таблицах 11 и 12.

'''Таблица 11. Результаты количественного определения суммы свободных а-аминокислот в шроте яблок.'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№ эксперимента</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска шрота яблок г</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска пролина, г</p></td><td colspan="2">
<p>Оптическая плотность при Х=400 нм продукта реакции</p></td><td>
<p>Содержание 1 суммы аминокислот относительно пролина, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Водного извлечения</p></td><td>
<p>Пролина</p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>0,030001</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,40091</p></td><td>
<p>0,52065</p></td><td>
<p>1,502</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>0,030004</p></td><td>
<p>0,000237</p></td><td>
<p>0,42839</p></td><td>
<p>0,52149</p></td><td>
<p>1,525</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>0,029991</p></td><td>
<p>0,000239</p></td><td>
<p>0,42524</p></td><td>
<p>0,51986</p></td><td>
<p>1,532</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>0,029995</p></td><td>
<p>0,000241</p></td><td>
<p>0,42326</p></td><td>
<p>0,51932</p></td><td>
<p>1,539</p></td></tr>
<tr><td>
<p>5</p></td><td>
<p>0,029989</p></td><td>
<p>0,000238</p></td><td>
<p>0,43000</p></td><td>
<p>0,51911</p></td><td>
<p>1,545</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>0,029984</p></td><td>
<p>0,000236</p></td><td>
<p>0,43435</p></td><td>
<p>0,51903</p></td><td>
<p>1,548</p></td></tr>
</table>

'''Таблица 12. Результаты количественного определения суммы свободных a-аминокислот в шроте яблок, очищенном от балластных ВМС.'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№ 1 эксперимента</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска шрота яблок Г </p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска пролина, г</p></td><td colspan="2">
<p>Оптическая плотность при Х= 400 нм продукта реакции</p></td><td rowspan="2">
<p>Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Водного</p>
<p>извлечения</p></td><td>
<p>Пролина</p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>0,024000</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,46662</p></td><td>
<p>0,52000</p></td><td>
<p>1,094</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>0,023978</p></td><td>
<p>0,000241</p></td><td>
<p>0,48768</p></td><td>
<p>0,51984</p></td><td>
<p>1,108</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>0,023971</p></td><td>
<p>0,000239</p></td><td>
<p>0,49254</p></td><td>
<p>0,51848</p></td><td>
<p>1,113</p></td></tr>
<tr><td>
<p><sup>4</sup></p></td><td>
<p>0,023985</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,48424</p></td><td>
<p>0,51824</p></td><td>
<p>1,117</p></td></tr>
<tr><td>
<p>5</p></td><td>
<p>0,023965</p></td><td>
<p>0,000237</p></td><td>
<p>0,49895</p></td><td>
<p>0,51817</p></td><td>
<p>1,119</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>0,023992</p></td><td>
<p>0,000245</p></td><td>
<p>0,48454</p></td><td>
<p>0,51821</p></td><td>
<p>1,122</p></td></tr>
</table>

Анализ данных табл. 11—12 показал, что содержание суммы    a-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %

В водном извлечении шрота яблок аминокислоты содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (в составе пептидов и белков). С целью повышения выхода суммы аминокислот из шрота яблок нами оптимизированы условия проведения кислотного гидролиза.

В качестве гидролизующего агента мы использовали раствор кислоты хлороводородной, обеспечивающей достаточно полное расщепление белков и пептидов водного извлечения до а-аминокислот. Кроме того, получаемые гидролизаты характеризуются высокой стабильностью, уменьшается вероятность их микробной контаминации, что является важным фактором при подготовке образцов к анализу.

Нами изучено влияние концентрации раствора кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот. К 5 г высушенного шрота яблок добавляют 35 мл воды и оставляют на 30 мин для набухания. Далее к сырью добавляют 65 мл раствора кислоты хлороводородной в концентрации от 0,45 М до 5,5 М и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 2 ч. Затем гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье, для его более полного истощения, трехкратно экстрагируют водой (в соотношении 1:6) по 30 мин в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют и объединяют с гидролизатом.

К объединенному гидролизату добавляют натрия гидрокарбонат до нейтральной реакции, переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. В результате кислотного гидролиза образуется комплекс балластных веществ (в т.ч. и продукты частичного гидролиза ВМС), снижающих качество готового продукта. Для очистки от данных веществ, к 20 мл гидролизата добавляют трехкратный объем 96 % этанола и отстаивают в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления этанола, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Далее нами проведена нингидриновая реакция, как описано выше (при количественном анализе свободных а-аминокислот шрота яблок) и установлено, что гидролиз шрота яблок 0,9 М раствором кислоты хлороводородной обеспечивает наиболее высокий выход суммы аминокислот (табл. 13).

'''Табл. 13.Влияние концентрации кислоты хлороводородной на выход суммы аминокислот.'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td>
<p>Концентрация кислоты хлороводородной, М</p></td><td>
<p>5,5</p></td><td>
<p>4,6</p></td><td>
<p>3,6</p></td><td>
<p>1,8</p></td><td>
<p>0,9</p></td><td>
<p>0,45</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Содержание суммы аминокислот в пересчете на пролин, %</p></td><td>
<p>0,17</p></td><td>
<p>0,31</p></td><td>
<p>0,52</p></td><td>
<p>0,64</p></td><td>
<p>0,85</p></td><td>
<p>0,66</p></td></tr>
</table>

В следующей серии экспериментов нами изучено влияние продолжительности гидролиза на выход суммы аминокислот. Кислотный гидролиз проводили 0,9 М раствором кислоты хлороводородной в интервале времени от 1 ч до 12 ч Установлено, что наибольший выход суммы аминокислот из шрота яблок (1,71 % в пересчете на пролин) наблюдается при продолжительности гидролиза в течение 10 часов (табл. 14). На нейтрализацию полученного извлечения израсходовано 5 г натрия гидрокарбоната.

'''Таблица 14. Влияние продолжительности кислотного гидролиза на выход суммы аминокислот'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td>
<p>Продолжительность гидролиза, ч</p></td><td>
<p>Выход суммы аминокислот, %</p></td><td>
<p>Продолжительность гидролиза, ч</p></td><td>
<p>Выход суммы аминокислот, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>0,59</p></td><td>
<p>7</p></td><td>
<p>1,42</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>0,85</p></td><td>
<p>8</p></td><td>
<p>1,51</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>0,96</p></td><td>
<p>9</p></td><td>
<p>1,58</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>1,08</p></td><td>
<p>10</p></td><td>
<p>1,71</p></td></tr>
<tr><td>
<p>5</p></td><td>
<p>1,19</p></td><td>
<p>11</p></td><td>
<p>1,56</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>1,30</p></td><td>
<p>12</p></td><td>
<p>1,28</p></td></tr>
</table>

Таким образом, нами оптимизированы условия кислотного гидролиза: к 5 г шрота яблок (точная навеска), высушенного до воздушно-сухого состояния, добавляют 35 мл воды очищенной и оставляют на 30 мин для набухания. Затем к набухшему сырью добавляют 65 мл 0,9 М раствора кислоты хлороводородной и проводят гидролиз при температуре 80-90 °С в течение 10 ч. Полученный гидролизат отделяют фильтрованием, а сырье трехкратно экстрагируют водой в аналогичном температурном режиме. Полученные извлечения фильтруют, объединяют с гидролизатом и проводят нейтрализацию добавлением 5 г натрия гидрокарбоната. Затем гидролизат переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят водой до метки. Далее проводят очистку гидролизата от балластных ВМС добавлением 96 % этанола, как описано выше. Следует отметить, что разработанный метод кислотного гидролиза не связан с использованием дорогого оборудования, характеризуется простотой исполнения и относительно небольшой продолжительностью во времени.

С целью изучения влияния балластных веществ на суммарное количественное содержание а-аминокислот в шроте яблок после гидролиза (в оптимизированных условиях), мы приготовили кислотный гидролизат без очистки от балластных веществ (образец 3) и гидролизат, очищенный от балластных веществ (образец 4) и затем провели нингидриновую реакцию (как описано выше). 2 мл каждого продукта разбавляли водой: до 10 мл (образец 3) и до 5 мл (образец 4).

На основании данных нингидриновой реакции были получены результаты количественного содержания суммы аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза и аналогичный показатель для образца, очищенного от балластных веществ (табл. 15 и 16).

'''Таблица 15. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок после кислотного гидролиза.'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№</p>
<p>эксперимента</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска шрота яблок г</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска пролина, г</p></td><td colspan="2">
<p>Оптическая плотность при X = 400 нм продукта реакции</p></td><td rowspan="2">
<p>Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Водного</p>
<p>извлечения</p></td><td>
<p>Пролина</p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>0,029982</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,40423</p></td><td>
<p>0,52285</p></td><td>
<p>1,509</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>0,029915</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,41568</p></td><td>
<p>0,52285</p></td><td>
<p>1,532</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>0,02993</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,41676</p></td><td>
<p>0,51884</p></td><td>
<p>1,539</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>0,029965</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,41873</p></td><td>
<p>0,51732</p></td><td>
<p>1,549 _</p></td></tr>
<tr><td>
<p>5</p></td><td>
<p>0,030015</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,41204</p></td><td>
<p>0,51762</p></td><td>
<p>1,552</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>0,030028</p></td><td>
<p>0,000254</p></td><td>
<p>0,40520</p></td><td>
<p>0,51802</p></td><td>
<p>1,555</p></td></tr>
</table>

'''Таблица 16. Результаты количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок, очищенного от балластных ВМС, после кислотного гидролиза'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№</p>
<p>эксперимента</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска шрота яблок г</p></td><td rowspan="2">
<p>Навеска пролина, г</p></td><td colspan="2">
<p>Оптическая плотность при \= 400 нм продукта реакции</p></td><td rowspan="2">
<p>Содержание суммы аминокислот относительно пролина, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Водного</p>
<p>извлечения</p></td><td>
<p>Пролина</p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>0,023978</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,73493</p></td><td>
<p>0,52279</p></td><td>
<p>1,681</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>0,023902</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,72279</p></td><td>
<p>0,51925</p></td><td>
<p>1,704</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>0,023895</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,72718</p></td><td>
<p>0,52012</p></td><td>
<p>1,712</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>0,023885</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,72709</p></td><td>
<p>0,51815</p></td><td>
<p>1,719</p></td></tr>
<tr><td>
<p>5</p></td><td>
<p>0,023444</p></td><td>
<p>0,000244</p></td><td>
<p>0,73021</p></td><td>
<p>0,51800</p></td><td>
<p>1,724</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>0,023815</p></td><td>
<p>0,000249</p></td><td>
<p>0,73017</p></td><td>
<p>0,51946</p></td><td>
<p>1,727</p></td></tr>
</table>

Анализ данных табл. 11, 12 и 15, 16 показал, что содержание суммы а-аминокислот в пересчете на пролин в исходном сырье составило 1,532 %, в сырье, очищенном от балластных ВМС, - 1,112 %. Аналогичный показатель для шрота яблок, подвергнутого кислотному гидролизу составил 1,539 % и 1,711 %, соответственно.

Статистическая обработка результатов анализа представлена в таблице 17, где номер каждого образца соответствует нумерации образцов при их подготовке к количественному определению суммы а-аминокислот.

'''Таблица 17. Статистическая обработка метода количественного определения суммы а-аминокислот в шроте яблок относительно пролина'''

<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td>
<p>№ образца</p></td><td>
<p>f</p></td><td>
<p>&lt;х&gt;, %</p></td><td>
<p>s<sup>2</sup>......|</p></td><td>
<p>s</p></td><td>
<p>P,%</p></td><td>
<p>Ax</p></td><td>
<p>6, %</p></td></tr>
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>5</p></td><td>
<p>1,532</p></td><td>
<p>2,85-1 O'<sup>4</sup></p></td><td>
<p>1,69-10'&quot;<sup>4</sup></p></td><td>
<p>95</p></td><td>
<p>0,0434</p></td><td>
<p>2,83</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>5</p></td><td>
<p>1,112</p></td><td>
<p>1,03 1 O'<sup>4</sup></p></td><td>
<p>1,01-КГ<sup>2</sup></p></td><td>
<p>95</p></td><td>
<p>0,026</p></td><td>
<p>2,34</p></td></tr>
<tr><td>
<p>3</p></td><td>
<p>5</p></td><td>
<p>1,539</p></td><td>
<p>2,95 10*<sup>4</sup></p></td><td>
<p>1,72-10'“</p></td><td>
<p>95</p></td><td>
<p>0,0442</p></td><td>
<p>2,87</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>5</p></td><td>
<p>1,711</p></td><td>
<p>2,89-1 О*<sup>4</sup></p></td><td>
<p>1,7-10*</p></td><td>
<p>95</p></td><td>
<p>0,0437</p></td><td>
<p>2,55</p></td></tr>
</table>

Как видно из данных таблицы 17, разработанный метод характеризуется достаточно высокой точностью определения и воспроизводимостью. Относительная ошибка результата отдельного определения для всех образцов не превышает ±3 %. Кроме того, метод прост и доступен в исполнении, не требует дорогостоящего аппаратурного оборудования и может быть использован для количественного определения суммы аминокислот в растительном сырье.

Однако, исходное извлечение шрота яблок (образец 1) и гидролизат (образец 3) содержат вещества, реагирующие с нингидрином (пептиды и белки), влияющие на изменения значений оптической плотности. Это приводит к ошибкам результатов количественного содержания а-аминокислот в сырье. Поэтому, для получения достоверных результатов, отражающих количественное содержание суммы а-аминокислот в растительном сырье, необходимо проводить его очистку от сопутствующих ВМС, например, с помощью осаждения этанолом, как описано выше.

Таким образом, проведение кислотного гидролиза способствует увеличению содержания суммы а-аминокислот в шроте яблок до 1,711 % в пересчете на пролин,что значительно превышает аналогичный показатель для исходного сырья - 1,112 %. Это позволит в дальнейшем разработать на основе кислотного гидролизата малотоксичные препараты широкого спектра фармакологической активности, обогащенные a-аминокислотами.

== Читайте также ==

*[[Нингидриновая реакция на определение аминокислот и белка]]
*[[Количественное определение глицина в таблетках]]