BCAA IPH AGAA


ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
«Исследование миопротекторных свойств пептида IPH-AGAA в культурах миоцитов крысы и человека»

1.	Перспективы применения пептидов в качестве миопротекторов
В настоящее время среди спортивного питания ведущую роль занимают биологически активные добавки (БАД) на основе протеинов и пептидов [Dudgeon W.D. et al., 2016]. Пептиды имеют ту же структуру, что и белки (протеины), но размер этих молекул меньше. Несмотря на широкий ассортимент БАД на основе пептидов для спортивного питания, зачастую их безопасность и эффективность не доказана. 
В течение многолетних научных и клинических исследований в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии были разработаны пептидные биорегуляторы для применения при различной патологии и в спорте [Хавинсон В.Х. и др., 2013]. Их применение способствовало повышению функций мозга, иммунной, сердечно-сосудистой систем, улучшению состояния костной и мышечной ткани, физической активности. 
Применение пептидных биорегуляторов футболистами клуба «Зенит» в течение 1999-2000 гг. позволило активировать резервные возможности спортсменов на 15%. На практике данное улучшение функционального состояния футболистов проявилось в уникальной (для чемпионата России 2000 г.) беспроигрышной серии из 13 матчей, а впоследствии выигрыша кубка России. На протяжении 2003-2008 гг. пептидные биорегуляторы ежегодно в периоды тренировок и восхождения использовали альпинисты из проекта «Русский путь – стены мира». В своих отчетах врач команд кандидат медицинских наук М.Н. Бакин отмечал, что применение пептидных биорегуляторов позволяет минимизировать симптомы горной болезни и повысить резервные возможности организма альпинистов.  Сборная команды Санкт-Петербурга по тяжелой атлетике в период с 2004 по 2005 гг. во время тренировок принимала пептидные биорегуляторы, что позволило спортсменам превысить личные рекорды и войти в сборную РФ. 
С 2009 по 2010 гг. было проведено исследование влияния пептидных биорегуляторов на резервные возможности организма спортсменок сборной команды РФ по художественной гимнастике. После приема пептидных биорегуляторов у спортсменок изменялась экспрессия генов HSPA1A и IL6. Эти гены отвечают за стрессоустойчивость и нормальное функционирование иммунной системы. Подтверждением геноспецифической стимуляции иммунной системы под действием пептидных биорегуляторов является тот факт, что после приема пептидов у 80% гимнасток снизилась заболеваемость острыми респираторными вирусными инфекциями. 
Важно также отметить, что короткие пептиды, являясь естественным продуктом обмена веществ, присутствующих в организме, не могут быть выявлены в крови или моче спортсмена, т.е. в отличие от искусственно синтезированных неприродных веществ, не может являться допингом и не имеет побочных эффектов. 
Таким образом, приведенные в качестве примера результаты исследований отечественных ученых свидетельствуют о перспективности применения пептидов для целей спортивной медицины и объясняют значительное повышение интереса к пептидным субстанциям среди производителей продуктов спортивного питания.
Целью настоящего исследования явилось изучение миопротекторных свойств пептида с условным названием «IPH-АGAA» в культурах миоцитов крысы и человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1.	Изучить влияние пептида IPH-АGAA в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл на экспрессию белка цитоскелета миоцитов виментина в культурах миоцитов крысы и человека.
2.	Оценить влияние пептида IPH-АGAA в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл на экспрессию транскрипционного фактора Pax7 - маркера пролиферации предшественников миоцитов в культурах миоцитов крысы и человека.
3.	Изучить влияние пептида IPH-АGAA в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл на экспрессию транскрипционного фактора Mif5 – раннего маркера дифференцировки скелетных мышц в культурах миоцитов крысы и человека.
4.	Оценить влияние пептида IPH-АGAA в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл на экспрессию транскрипционного фактора р53 - маркера апоптоза в культурах миоцитов крысы и человека.
5.	Оценить влияние пептида IPH-АGAA в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл на экспрессию транскрипционного фактора Ki67 - маркера пролиферации в культурах миоцитов крысы и человека.
6.	Высказать предположение о механизмах миопротекторного действия пептида IPH-АGAA.

2. Материалы и методы исследования
2.1. Общая характеристика работы
Исследование миопротекторных свойств пептида IPH-АGAA проводили на первичных культурах миоцитов крыс и культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
Первичные культуры миоцитов крыс получали из бедренных мышц крыс линии Wistar. В исследовании использовали 3 месячных самцов крыс массой 270-320 г. Для выделения культуры применяли методику, описанную Чепелевой и соавт. (2015). Крыс содержали на стандартном пищевом рационе, со свободным доступом к воде и 12 часовым циклом смены светового режима (день-ночь).
Культуру мышцы эмбриона человека линии FetMSC заказывали в Коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). При каждом пересеве в ростовую среду добавляли раствор с пептидом IPH-АGAA или контрольным пептидом. Клетки культивировали до 3-го пассажа, на котором проводили иммунофлуоресцентное окрашивание. Культуры клеток мышц крысы и человека были разделены на 5 групп каждая: 
1 группа - контроль (добавление питательной среды), 
2 группа - добавление пептида IPH-АGAA в концентрации 2 нг/мл, 
3 группа – добавление пептида IPH-АGAA в концентрации 20 нг/мл,
4 группа – добавление пептида IPH-АGAA в концентрации 200 нг/мл,
5 группа – добавление контрольного пептида Lys-Glu в концентрации 20 нг/мл.
 Для большинства диссоциированных клеточных культур, как было показано ранее, наиболее эффективной является концентрация пептидов 20 нг/мл [Линькова Н.С. и др., 2016; Khavinson V. et al., 2017]. Поскольку ранее пептид IPH-АGAA в диссоциированных культурах клеток миоцитов не изучался, выбрали 3 указанные выше концентрации, исходя из предыдущего опыта экспериментальной работы с другими культурами клеток и пептидами. В качестве контроля выбран иммунопротекторный пептид Lys-Glu с известными и хорошо описанными в литературе свойствами [Хавинсон В.Х., 2009].

2.2. Приготовление раствора пептидов для добавления в культуры клеток
Для исследования использовали пептиды IPH-АGAA и Lys-Glu в форме лиофилизированного порошка. Осуществляли последовательное разведение пептидов питательной средой для культивирования культур до получения конечных концентраций раствора 2 нг/мл, 20 нг/мл, 200 нг/мл. 

2.3. Выделение первичной культуры миоцитов крыс
Культуры клеток получали из бедренных мышц крыс линии Вистар. Изолированную мышечную ткань измельчали и помещали в 0,2% раствор коллагеназы NB4 (Serva) в течение 30 мин при температуре 37 °С. Часть полученных клеток высаживали на культуральный пластик без подложки в ростовой среде DMEM/F12 (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (foetal bovine serum, FBS; Autogene Bioclear), 100 Ед/мл пенициллина (Gibco), 100 Ед/мл стрептомицина (Gibco), 2 ммоль/л L-глутамина (Invitrogen). Смену среды проводили каждые трое суток. Для неспецифической дифференцировки полученной культуры проводили инкубацию с дексаметазоном (10–8 М) в течение 10 дней. Оставшиеся клетки полученной первичной культуры высаживали на культуральный пластик в слое матригеля с пониженным содержанием ростовых факторов (BD Biosciences). Матригель предварительно заливали в культуральные флаконы из расчета 50 мкл/см2 и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Для культивирования использовали среду DMEM/F12 (Invitrogen) с добавлением 10% FBS (Autogene Bioclear), 100 Ед/мл пенициллина (Gibco), 100 Ед/мл стрептомицина (Gibco), 2 ммоль/л L-глутамина (Invitrogen). Смену среды проводили каждые трое суток [Чепелева Е.В. и др., 2015]. Общий вид культуры миоцитов крысы представлен на рисунке 1.
Рис. 1. Первичная культура миоцитов крысы. Прижизненная световая микроскопия, х200. 

2.4. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC
Происхождение: человек, мезенхимные стволовые клетки из мышцы конечности 5-6 недельного эмбриона 
Цитология. 2014. 56 (8): 562 – 573. 
Морфология: фибробластоподобная. 
Способ культивирования: монослойный. 
Условия культивирования: среда - DMEM/F12.
Сыворотка - эмбриональная бычья 10%. 
Процедура пересева - cнятие клеток, достигнувших 80 % монослоя, используя трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:1, Sigma), кратность рассева 1:5, оптимальная плотность 4.0 – 5.0×104 клеток/см2. 
Криоконсервация - ростовая среда, 10% DMSO, 1.5-2.0×10 6 клеток/мл в ампуле. 
Жизнеспособность после криоконсервации: 90 % (окраска трипановым синим на нулевом пассаже). 
Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены. 
Контроль видовой идентичности: кариологический анализ. 
Кариология: 2n=46, модальное число хромосом 46 (99.1±0.9%), нормальный кариотип человека (46, XY), количество полиплоидов 2.2 %. 
Другие характеристики: 
Среднее время одного удвоения клеточной популяции 25.0 ч; активный рост клеток начинается через 24 ч и продолжается до 96 ч. 
Линия с ограниченным сроком жизни, до 50 удвоений клеточной популяции не наблюдается снижения пролиферативной активности. 
Экспрессия поверхностных антигенов, характерных для мезенхимных стволовых клеток: CD44, CD73, CD90, CD105, виментин и HLA-ABC; отсутствие экспрессии антигенов CD34 и HLA-DR. 
Направленная дифференцировка в адипогенном (сниженный потенциал), остеогенном и хондрогенном направлениях. 
Возможна индуцированная скелетно-мышечная дифференцировка с образованием миотуб и выявлением мышечных белков в Z-дисках. 
Область применения: миогенез, клеточная дифференцировка, клеточная биология, биотехнология, фидер для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека. 
Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) Института цитологии РАН 

2.5. Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Выявление маркерных молекул осуществляли иммунофлуоресцентным методом с использованием первичных антител к Myf5 (1:100, Abcam), Pax7 (1:250, Abcam), Ki67 (1:75, Abcam), p53 (1:50, Abcam), виментин (1:100, Abcam). В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000, Abcam, зеленая флуоресценция) или Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam, красная флуоресценция). 
Указанные молекулярные маркеры миоцитов были выбраны для того, чтобы охарактеризовать основные физиологические процессы онтогенеза миоцитов. При формировании мышц во время эмбрионального развития одним из ключевых событий является слияние миобластов (клеток - предшественников мышечных клеток) в единое многоядерное мышечное волокно — синцитий (рис. 2).  Рис. 2. Схема дифференцировки миобластов и образования многоядерного синцития [по Bentzinger C.F. et al., 2012].
Закладка мышечной ткани и формирование мышц — миогенез— происходит во время внутриутробного развития в несколько стадий, каждая из которых управляется различными белками. Основными стадиями миогенеза являются: деламинация (разделение слоев клеток), миграция клеток, пролиферация (разрастание ткани путем деления клеток) и два этапа дифференцировки. Эти стадии происходят на внутриклеточном уровне, это первый этап миогенеза. На втором этапе происходит формирование самой мышечной ткани, для чего необходимы стадия слияния клеток в вытянутые многоядерные мышечные клетки — миоциты и образование мышечных волокон, а также стадия образования клеток-сателлитов (то есть клеток, необходимых для регенерации, восстановления и роста мускулатуры уже во взрослом состоянии).
Белок Pax7 – транскрипционный фактор, который играет ключевую роль в миогенезе, регулируя пролиферацию предшественников миоцитов. Свою функцию Pax7 выполняет, связываясь с ДНК в виде димера с транскрипционным фактором Pax3 и взаимодействуя с белком PAXBP1. Также Pax7 связывается с метилтрансферазой гистона WDR5. Pax7 экспрессируется в сателлитных клетках мышечной ткани, в нервной ткани и сперматогониях. Ген, кодирующий белок Pax7, является фактором подавления онкогенеза, т.к. при мутации в этом гене развивается альвеолярная рабдомиосаркома [Parker M.H. et al., 2003; Magli A. et al., 2017].
Белок Mif5 (Myogenic factor 5) – ключевой транскрипционный фактор регуляции миогенеза скелетных мышц. Принадлежит к семейству миогенных регуляторных факторов (MRFs), включающих в себя также белки     MyoD(Myf3), миогенин, MRF4 (Myf6).  Из всех транскрипционных факторов семейства MRFs Mif5 является самым ранним фактором дифференцировки и начинает экспрессироваться еще в эмбриогенезе. Mif5 индуцирует дифференцировку полипотентных миогенных клеток в направлении скелетных мышц [Kim A.R. et al., 2017].
Белок Ki67 является общепризнанным и широко используемым маркером пролиферации, экспрессирующимся во всех типах тканей. Процесс старения характеризуется достижением предела Хейфлика и снижением либо полным прекращением способности клеток к делению. В связи с этим белок Ki67 может являться важным маркером для оценки снижения пролиферативной активности клеток и степени инволютивных процессов в исследуемом органе [Romero Q. et al., 2014].
Белок р53 является транскрипционным фактором, выполняющим функцию супрессора образования злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма. Белок р53 активируется при повреждениях ДНК, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям или являются сигналом о старении клетки и нарушении ее функциональной активности [Arshad H. et al., 2010].
Виментин (Vimentin) — белок промежуточных филаментов соединительных тканей и других тканей мезодермального происхождения, в том числе миоцитов.  Виментин участвует в построении цитоскелета клетки. Несмотря на то, что большинство промежуточных филаментов — это устойчивые структуры, в фибробластах и дифференцирующихся миоцитах содержащие виментин филаменты являются динамической структурой [Zhang C. et al., 2017]. 
Изучение влияния исследуемого пептида на экспрессию перечисленных маркерных молекул позволяет, с одной стороны, установить наличие миопротекторных свойств пептида, с другой - выявить молекулярный механизм миопротекторного действия пептида на разных этапах формирования мышечной ткани, что важно для определения перспективности применения пептида у спортсменов, занимающихся силовыми видами спорта, требующими увеличения мышечной массы.Рис. 3. Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия культуры мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC, 3 пассаж, ×200: А – экспрессия Pax7 (Alexa Fluor 647, красная флуоресценция), Б - экспрессия Myf5 (Alexa Fluor 488, зеленая флуоресценция). Красный горизонтальный штрих в правом нижнем углу микрофотографии – масштабная линейка, 20 мкм.

Окрашивание препаратов проводили по стандартному протоколу:
1.	Промывка клеточной культуры раствором PBS.
2.	Фиксация клеток: для фиксации используется 4% раствор параформальдегида на PBS (инкубация в течение 15 минут при комнатной температуре).
3.	Промывка раствором PBS (три смены по 3 минуты).
4.	Отмывка дистиллированной водой (3 минуты).
5.	Пермеабилизация клеток осуществляется 0,25-0,5% раствором Triton X-100 на PBS (Биолот, РФ) в течение 15 минут при комнатной температуре.
6.	Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
7.	Инкубация в 1% бычьем сывороточном альбумине, разведенным PBS, pH 7,5 в течение 15 минут для блокировки неспецифического связывания.
8.	Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
9.	Инкубация с первичными антителами (время и условия инкубации установлены производителем в инструкции к антителам).
10.	Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
11.	Инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 647, в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
12.	Промывка в трех сменах PBS (по 3 минуты).
13.	Готовые препараты заключить под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США) и хранить в темноте, во избежание быстрого выгорания флуорохрома.

На рисунке 3 приведены примеры ядерной экспрессии белков Pax7 и Myf5 в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC.


2.6. Морфометрия
Для анализа полученных результатов использовали конфокальный микроскоп Olympus FluoView 1000 (Япония), программное обеспечение «Olympus FluoView ver 3.1b». В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении ×200. Проводили измерение относительной площади экспрессии в %. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах для маркера с цитоплазматическим окрашиванием (виментин), а также как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными ядрами, к общей площади ядер в поле зрения для маркеров с ядерной экспрессией (Myf5, Pax7, р53, Ki67). 

2.7. Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка экспериментальных данных включала 
в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения 
и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась 
в программе Statistica 6.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk’s W-test). Если данные подчинялись нормальному распределению, различия в средних определялись с помощью критерия Стюдента (t).  В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, 
для последующего выявления неоднородных групп (путем их попарных сравнений) применяли процедуры множественных сравнений с помощью 
U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.

3.	Результаты исследования и их обсуждение

3.1.	Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию виментина в культурах миоцитов крысы и человека 
В контрольной культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC площадь экспрессии маркера цитоскелета виментина составила 2,76±0,35%. Пептиды IPH-AGAA в концентрациях 2 и 20 нг/мл и Lys-Glu в концентрации 20 нг/мл не влияли на экспрессию виментина в культуре миоцитов человека (рис. 5). Пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию виментина в 1,8 по сравнению с контролем (рис. 4,5).
В контрольной первичной культуре бедренных мышц крыс площадь экспрессии виментина составила 1,65±0,22%. Пептид IPH-AGAA в концентрациях 2 нг/мл и 200 нг/мл и пептид Lys-Glu в концентрации 20 нг/мл не влияли на экспрессию виментина в культуре миоцитов крысы (рис. 6). Пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию виментина в 1,3 раза по сравнению с контролем (рис. 6).Рис. 4. Экспрессия виментина (Alexa Fluor 647, красная флуоресценция) в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия, ×200: А – контроль, Б – добавление пептида IPH-AGAA, 20 нг/мл. Рис. 5. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию виментина в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

Более выраженное влияние пептида IPH-AGAA на ремоделироване промежуточных филаментов цитоскелета в культуре эмбриональных миоцитов человека по сравнению с клетками крысы может быть связано с двумя причинами. Во-первых, для эмбриональных клеток процессы изменения цитоскелета более выражены, т.к. клетки в них подвергаются дифференцировке. Во-вторых, полученные различия в эффекте пептида IPH-AGAA могут быть обусловлены видовыми особенностями миоцитов.
Рис. 6. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию виментина в первичной культуре бедренных мышц крыс. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

3.2.	Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Pax7 в культурах миоцитов крысы и человека 
В контрольной культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC площадь экспрессии транскрипционного фактора пролиферации незрелых миоцитов Pax7 составила 3,58±0,33%. Пептид IPH-AGAA в концентрациях 2 нг/мл и 200 нг/мл и пептид Lys-Glu концентрации 20 нг/мл не влияли на экспрессию Pax7 в культуре миоцитов человека (рис. 7). Пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию Pax7 в 1,2 раза по сравнению с контролем (рис. 7).
Рис. 7. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Pax7 в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

В контрольной первичной культуре бедренных мышц крыс площадь экспрессии Pax7 составила 1,15±0,15%. Пептид IPH-AGAA в концентрациях 2 нг/мл, 20 нг/мл, 200 нг/мл и Lys-Glu повышали экспрессию Pax7 в культуре миоцитов крысы, соответственно, в 1,8; 4,6; 3,9 и 1,3 раза по сравнению с контролем (рис. 8). 
Более выраженное влияние пептида IPH-AGAA на пролиферацию предшественников миоцитов в культуре, полученной от крыс, по сравнению с человеческой эмбриональной культурой можно объяснить, исходя из результатов по действию пептида IPH-AGAA на экспрессию виментина. Представляется вероятным, что в культуре миоцитов человека пептид IPH-AGAA, оказывая влияние на ремоделирование цитоскелета, будет регулировать дифференцировку клеток. В то же время, в культуре миоцитов крыс пептид IPH-AGAA в меньшей степени влияет на ремоделирование цитоскелета, но стимулирует пролиферацию незрелых миоцитов.
Рис. 8. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Pax7 в первичной культуре бедренных мышц крыс. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

3.3.	Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Mif5 в культурах миоцитов крысы и человека 
В контрольной культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC площадь экспрессии транскрипционного фактора дифференцировки миоцитов Mif5 составила 2,21±0,18%. Пептид IPH-AGAA в концентрации 2 нг/мл и пептид Lys-Glu не влияли на экспрессию Mif5 в культуре миоцитов человека (рис. 9). Пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию Mif5, соответственно, в 2,9 и 2,8 раза по сравнению с контролем (рис. 9). 
Рис. 9. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Mif5 в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.Рис. 10. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Mif5 в первичной культуре бедренных мышц крыс. 

В контрольной первичной культуре бедренных мышц крыс площадь экспрессии Mif5 составила 0,70±0,05%. Пептиды Lys-Glu и IPH-AGAA ни в одной из исследуемых концентраций не влиял на экспрессию Mif5 (рис. 10).
Полученные данные показали, что пептид IPH-AGAA стимулирует дифференцировку предшественников миоцитов только в культуре клеток человека, но не оказывает такого эффекта на клетки крыс. Этот эффект может быть связан с тем, что культура клеток миоцитов человека, используемая в исследовании, была эмбриональной, т.е. содержала большое количество незрелых миоцитов, способных к дифференцировке. Также эффект пептида может быть обусловлен межвидовыми различиями миоцитов человека и животных. Данные, указывающие на способность пептида IPH-AGAA индуцировать дифференцировку миоцитов человека, хорошо согласуются с результатами по влиянию пептида на экспрессию виментина и транскрипционного фактора пролиферации Pax7.

3.4.	Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию р53 в культурах миоцитов крысы и человека
В контрольной культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC площадь экспрессии транскрипционного фактора апоптоза р53 составила 0,63±0,05%. Пептид IPH-AGAA в концентрации 2 нг/мл и пептид Lys-Glu не влияли на экспрессию р53 в культуре миоцитов человека (рис. 11). Пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл понижал экспрессию р53, соответственно, в 1,6 и 1,5 раза по сравнению с контролем (рис. 11).
Рис. 11. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию р53 в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

В контрольной первичной культуре бедренных мышц крыс площадь экспрессии р53 составила 0,57±0,05%. Пептид IPH-AGAA в концентрации 2 нг/мл и пептид Lys-Glu не влияли экспрессию р53 в культуре миоцитов крысы (рис. 12). Пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл снижал экспрессию транскрипционного фактора р53 соответственно в 1,7 и 1,6 по сравнению с контролем (рис. 12). Рис. 12. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию р53 в первичной культуре бедренных мышц крыс. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

В культурах миоцитов человека и крыс пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл оказывал одинаковый антиапоптотический эффект, хотя и не сильно выраженный. Полученные данные можно объяснить тем, что в культурах миоцитов эмбриона и культурах, полученных от молодых крыс, процессы апотоза выражены слабо (это подтверждается и низкими контрольными значениями экспрессии р53). Поскольку пептиды обладают регуляторными свойствами и их эффект направлен на поддержание гомеостаза клеток, то в данной экспериментальной модели антиапоптотический эффект пептида IPH-AGAA выражен не сильно.

3.5.	Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Ki67 в культурах миоцитов крысы и человека 
В контрольной культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC площадь экспрессии пролиферотропного протеина Ki67 составила 2,79±0,21%. Пептид IPH-AGAA в концентрации 2 нг/мл и пептид Lys-Glu не влияли на экспрессию Ki67 в культуре миоцитов человека (рис. 13). Пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию Ki67 в 1,2 по сравнению с контролем (рис. 13).
В контрольной первичной культуре бедренных мышц крыс площадь экспрессии Ki67 составила 4,35±0,37%. Пептид IPH-AGAA в концентрации 2 нг/мл и пептид Lys-Glu не влияли экспрессию Ki67 в культуре миоцитов крысы (рис. 14). Пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию транскрипционного фактора Ki67 в 1,3 раза по сравнению с контролем (рис. 14).Рис. 13. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Ki67 в культуре мезенхимных стволовых клеток из мышцы эмбриона человека линии FetMSC. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем. Рис. 14. Влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Ki67 в первичной культуре бедренных мышц крыс. 
* - р < 0,05 по сравнению с контролем. 

Влияние пептида IPH-AGAA на пролиферацию миоцитов человека, оцениваемое по специфическому для миоидных клеток фактору транскрипции Рах7 и неспецифическому маркеру Ki67 носит однонаправленный характер. Однако стимулирующее влияние пептида IPH-AGAA на экспрессию Ki67 выявлено в двух концентрациях, а для белка Рах7 – только в одной. Пептид IPH-AGAA оказывает более выраженное действие на специфический маркер пролиферации миоцитов Рах7 в культуре клеток крыс по сравнению с его действием на неспецифический пролиферотропный протеин Ki67.
Таким образом, пептид IPH-AGAA проявляет миопротекторные свойства, выражающиеся в усилении пролиферативных и снижении апоптотических процессов в мышечных клетках, что делает его перспективным для использования в спорте. 
ВЫВОДЫ
1.	В культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию виментина, в 1,8 раза по сравнению с контролем. В первичной культуре бедренных мышц крыс пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию виментина в 1,3 раза по сравнению с контролем.
2.	В культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC пептид IPH-AGAA в концентрации 20 нг/мл повышал экспрессию специфического маркера пролиферации миоцитов Pax7 в 1,2 раза по сравнению с контролем. В первичной культуре бедренных мышц крыс пептид IPH-AGAA в концентрациях 2 нг/мл, 20 нг/мл, 200 нг/мл повышали экспрессию Pax7, соответственно, в 1,8, 4,6 и 3,9 раза по сравнению с контролем.
3.	В культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию фактора дифференцировки миоцитов Mif5, соответственно, в 2,9 и 2,8 раза по сравнению с контролем. В первичной культуре бедренных мышц крыс пептид IPH-AGAA ни в одной из исследуемых концентраций не влиял на экспрессию Mif5.
4.	В культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл снижал экспрессию р53, соответственно, в 1,6 и 1,5 раза по сравнению с контролем. В первичной культуре бедренных мышц крыс пептид IPH-AGAA снижал экспрессию р53, соответственно, в 1,7 и 1,6 по сравнению с контролем.
5.	В культуре мезенхимных стволовых клеток мышцы эмбриона человека линии FetMSC пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию Ki67 в 1,2 раза по сравнению с контролем. В первичной культуре бедренных мышц крыс пептид IPH-AGAA в концентрациях 20 нг/мл и 200 нг/мл повышал экспрессию Ki67 в 1,3 раза по сравнению с контролем.
6.	Миопротекторный эффект пептида IPH-AGAA основан на его способности снижать выраженность апоптоза и стимулировать дифференцировку миоцитов человека. В миоцитах крыс пептид IPH-AGAA также снижает выраженность апоптоза, но в большей степени стимулирует не дифференцировку, а пролиферацию миоидных клеток.

Литература
1.	Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хвинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2016. - №1. – С. 40-44.
2.	Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. СПб.: Наука, 2009. - 50 с.
3.	Хавинсон В.Х., Трофимова С.В., Трофимов А.В., Качан Е.Ю., Винер-Усманова И.А., Терехина Р.Н., Крючек Е.С., Пирожкова Е.А. Методика повышения уровня подготовленности гимнасток высокого класса на основе использования средств специальной физической подготовки и пептидных биорегуляторов. // Методические рекомендации. – СПб.: СПб Институт биорегуляции и геронтологии. – 2013. – 44 с.
4.	Чепелева Е.В., Павлова С.В., Малахова А.А., Покушалов Е.А., Закиян С.М. Получение культуры клеток из скелетной мускулатуры крысы для применения в клеточной терапии ишемических поражений сердца //Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2015. - Т. 19. - № 4–2. - С. 28–32.
5.	Arshad H., Ahmad Z., Hasan S.H. Gliomas: correlation of histologic grade, Ki67 and p53 expression with patient survival // Asian Pac J Cancer Prev. – 2010. – Vol. 11. – N 6. – P. 1637-1640;
6.	Bentzinger C.F., Wang Y.X., Rudnicki M. A.  Building muscle: molecular regulation of myogenesis // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. - 2012. - Vol. 4. - P. a008342.
7.	Dudgeon W.D., Kelley E.P., Scheett T.P. In a single-blind, matched group design: branched-chain amino acid supplementation and resistance training maintains lean body mass during a caloric restricted diet //J Int Soc Sports Nutr. 2016. -  Vol. 13, N 1. doi: 10.1186/s12970-015-0112-9.
8.	Khavinson V., Linkova N., Kukanova E., Bolshakova A., Gainullina A., Tendler S., Morozova E., Tarnovskaya S., Vinski D.S.P., Bakulev V., Kasyanenko N. Neuroprotective Effect of EDR Peptide in Mouse Model of Huntington’s Disease // J. of Neurology and Neuroscience. – 2017. - Vol.8. -  No.1:166. – P. 1-11.
9.	Kim A.R., Kim K.M., Byun M.R., Hwang J.H., Park J.I., Oh H.T., Kim H.K., Jeong M.G., Hwang E.S., Hong J.H. Catechins activate muscle stem cells by Myf5 induction and stimulate muscle regeneration // Biochem Biophys Res Commun. – 2017. – Vol. 489, N 2. – P. 142-148.
10.	Magli A., Incitti T., Kiley J., Swanson S.A., Darabi R., Rinaldi F., Selvaraj S., Yamamoto A., Tolar J., Yuan C., Stewart R., Thomson J.A., Perlingeiro R.C.R. PAX7 Targets, CD54, Integrin α9β1, and SDC2, Allow Isolation of Human ESC/iPSC-Derived Myogenic Progenitors // Cell Rep. – 2017/ Vol. 19, N 13. – P. 2867-2877.
11.	Parker M.H., Seale P., Rudnicki M.A. Looking back to the embryo: defining transcriptional networks in adult myogenesis // Nature Reviews Genetics. - 2003.-  Vol. 4, № 7. - P. 497–507.
12.	Romero Q., Bendahl P.O., Ferno M. A novel model for Ki67 assessment in breast cancer. // Diagn Pathol. – 2014. – V. 16. – N 9. – P. 118.
13.	Zhang C., Gong P., Ye Y., Zhang L., Chen M., Hu Y., Gu A., Chen S., Wang Y. NF-κB-vimentin is involved in steroidogenesis stimulated by mono-butyl phthalate in primary cultured ovarian granulosa cells // Toxicol In Vitro. – 2017. - pii: S0887-2333(17)30199-6.