Редактирование: Алкилирующие средства

{{Клинфарм3}}
== '''Алкилирующие средства''' ==

=== Историческая справка ===

Сернистый иприт β,β'-дихлордиэтилсульфид) был синтезирован в 1854 г., но его кожно-нарывное действие описано лишь в 1887 г. В Первую мировую войну врачи уделяли основное внимание действию сернистого иприта на кожу, глаза и дыхательные пути. Позже выяснилось, что он вызывает и тяжелое системное поражение. В 1919 г. Крумбхаар и Крумбхаар опубликовали данные, согласно которым для отравления сернистым ипритом характерна лейкопения, а на аутопсии обнаруживаются аплазия костного мозга, атрофия лимфоидной ткани и изъязвление слизистой ЖКТ.

Между двумя мировыми войнами активно исследовали химические и биологические свойства азотистых ипритов (хлорэтиламинов). Выраженная токсичность этих веществ по отношению к лимфоидной ткани навела Гилмана, Гудмана и Догерти на мысль изучить их действие на перевиваемую лимфосаркому мышей. В 1942 г. прошли первые клинические испытания, положившие начало современной химиотерапии (Gilman, 1963).

Поскольку азотистые иприты рассматривались как боевые отравляющие вещества, в то время все исследования были засекречены. Результаты были опубликованы лишь по окончании Второй мировой войны (см. Gilman and Philips, 1946, а также более поздний обзор Ludlum and Tong, 1985).

Синтезированы тысячи производных хлорэтиламинов, но из них лишь единицы в определенных клинических ситуациях оказались лучше первого препарата этой группы — хлорметина. В настоящее время используются 5 основных подклассов алкилирующих средств: 1) хлорэтиламины, 2) этиленимины, 3) алкилсульфонаты, 4) производные нитрозомочевины и 5) триазены.

=== Химические свойства === 

Все алкилирующие средства имеют сильные электрофильные группы, которые путем образования карбкатионов или переходных комплексов взаимодействуют с нуклеофильными группами (фосфатными, сульфгидрильными, ими-дазольными, гидрокси-, карбокси- и аминогруппами) других молекул с образованием ковалентной связи. Цитотоксическое действие этих препаратов напрямую связано с алкилированием ДНК. Бифункциональные алкилирующие средства (например, хлорэтиламины) наиболее активно соединяются с атомом N-7 гуанина — возможно, их биологическое действие связано главным образом с этой реакцией. Однако алкилированию подвергаются и другие атомы азотистых оснований (особенно атомы N-1 и N-3 аденина, N-3 цитозина и 0-6 гуанина), а также фосфатные группы ДНК, аминогруппы и сульфгидрильные группы белков.

Рассмотрим взаимодействие алкилирующих средств с атомом N-7 гуанина на примере хлорметина (рис. 52.1). На первом этапе протекает реакция мономолекулярного нуклеофильного замещения (SN1) с высвобождением аниона хлора, образованием карбкатиона и замыканием одной из хлорэтильных групп в положительно заряженное этилениминовое кольцо — образуется высокоактивное промежуточное соединение (рис. 52.1, А). Третичный азот хлорметина становится нестабильным четвертичным, и промежуточное соединение быстро реагирует с нуклеофильными (электроотрицательными) участками различных молекул. Эти реакции идут по механизму бимолекулярного нуклеофильного замещения (SN2). Алкилирование азота гуанина (рис. 52.1, Б) имеет ряд важных последствий. Во-первых, гуанин находится в ДНК преимущественно в лактамной форме, что позволяет ему образовывать водородные связи с цитозином 
комплементарной цепи. Однако при алкилировании гуанина атом N-7 становится четвертичным, получая положительный заряд, из-за чего гуанин приобретает свойства кислоты и переходит в лактимную форму. При репликации ДНК измененный гуанин образует пару уже не с цитозином, а с тимином, что ведет к замене пары гуанин—цитозин на пару аденин—тимин. Во-вторых, алкилирование дестабилизирует имидазольное кольцо гуанина, что приводит к раскрытию кольца и отщеплению гуанина. Все эти повреждения ДНК требуют репарации. В-третьих, хлорэтиламины (например, хлорметин) способны к циклизации второй хлорэтильной группы и алкилированию второго гуанина или другой нуклеофильной группы с образованием сшивки цепей ДНК или ДНК с белком, что резко нарушает функцию ДНК. Как цитотоксичность, так и мутагенность алкилирующих средств можно объяснить любым из перечисленных процессов, однако активность бифункциональных алкилирующих средств коррелирует именно с числом сшивок между цепями ДНК (Garcia et al., 1988). Механизм гибели поврежденных клеток до конца не ясен (см. ниже, «Механизм действия»).

Все хлорэтиламины неустойчивы, хотя и в различной степени, поэтому при использовании каждого из этих препаратов надо учитывать его химические свойства. Так, хлорметин крайне нестабилен и почти полностью вступает в химические реакции уже через несколько минут после введения. Другие препараты, например хлорамбуцил, достаточно устойчивы для приема внутрь. Действие циклофосфамида проявляется только после его активации микросомальными ферментами печени.

Этиленимины (например, ''ТиоТЭФ'') реагируют по механизму бимолекулярного нуклеофильного замещения (SN2); поскольку раскрытие этилениминового кольца катализируется ионами Н+, они более активны при низком pH. 

==== Структурно-функциональная зависимость ====

Алкилирующие средства — неоднородная группа соединений, которые способны in vivo вызывать присоединение алкильных групп к ДНК и другим макромолекулам. Активность препарата зависит от его физических и химических свойств — липофильности, способности проникать через биологические мембраны, Kd, устойчивости в водном растворе и сродства к различным участкам макромолекул. Некоторые наиболее эффективные препараты, например циклофосфамид и производные нитрозомочевины, приобретают способность к алкилированию лишь in vivo в результате сложных химических превращений.

Хлорэтиламины, или азотистые иприты, можно рассматривать как аналоги сернистого иприта, в котором сера замещена азотом: их активность обеспечивают также две хлорэтильные группы. В прошлом широко применялся ''хлорметин'', но затем были получены его модификации с большей устойчивостью и избирательностью действия, а потому и менее токсичные. Чтобы создать устойчивые препараты для приема внутрь, активный фрагмент хлорметина соединяли с аминокислотами (например, с фенилаланином — так был получен ''мелфалан''), замешенным бензольным кольцом (например, с фенилбутиратом — так был получен ''хлорамбуцил''), пиримидинами (например, с урацилом) и другими веществами (рис. 52.2). Хотя высокой избирательности достичь не удалось, некоторые из полученных препаратов обладали важными преимуществами перед хлорметином.

Относительно устойчивые хлорэтиламины удалось получить путем соединения с замещенным бензольным кольцом. За счет смещения к нему электронной плотности от азота у этих веществ сильно снижена способность к образованию этилениминового кольца и карбкатионов, что позволяет им не сразу реагировать с макромолекулами крови и других тканей, а распределяться по всему организму. Среди ароматических хлорэтилами-нов основное значение имеют хлорамбуцил и мелфалан, эти препараты можно назначать внутрь.

Роль метаболической активации в действии алкилируюших средств хорошо видна на примере циклофосфамида, наиболее широко применяемого препарата из этой группы. При его разработке исходили из двух предположений. Во-первых, что замещение метильной группы хлорметина оксазафосфориновым кольцом снизит реактивность, так как хлорэтильные группы не смогут ионизироваться, пока не будет расщеплена фосфоамид-ная связь в этом кольце. Во-вторых, что в опухолях повышена активность фосфатаз и фосфамидаз, способных расщеплять оксазафосфориновое кольцо, обеспечивая таким образом избирательную активацию препарата в опухолевых клетках. Как и предполагалось, циклофосфамид обладает достаточной устойчивостью в водном растворе, а его алкилируюшая, цитотоксическая и мутагенная активность in vitro оказались слабыми. В то лее время при введении онкологическим больным и экспериментальным животным препарат проявлял выраженную противоопухолевую активность, а кроме того, обладал мутагенным и канцерогенным действием. Однако гипотеза об активации циклофосфамида фосфатазами и фосфамидазами оказалась неверной. В действительности он гидроксилируется микросомальными ферментами печени (рис. 52.3), и затем его активные метаболиты попадают в опухолевые клетки (см. ниже). Избирательное действие циклофосфамида на некоторые опухоли частично объясняется способностью нормальных тканей, например ткани печени, разрушать эти метаболиты с помощью альдегиддегидрогеназы и других ферментов.

Рисунок 52.3. Метаболизм циклофосфамида.

''Ифосфамид'', как и циклофосфамид, содержит оксазафосфо-риновое кольцо. Оба препарата содержат по две хлорэтильные группы, но у и фосфа мида одна из них связана с азотом оксаза-фосфоринового кольца, тогда как у циклофосфамида обе группы связаны с внециклическим азотом. Ифосфамид также активируется в печени путем гид роке ил ирован ия, однако его активация происходит медленнее. При этом значительная часть хлорэтильных групп окисляется до хлораиетальдегида. Очевидно, с этим связаны необходимость применения более высоких доз и фосфамида и некоторые различия в спектре противоопухолевой активности.

Производное триазена ''дакарбазин'' (5-(3,3-диметил-1-триазе-но)-имидазол-4-карбоксамид] вначале считался антиметаболитом, однако он действует как алкилирующее средство. Его структурная формула следующая:

Рисунок 52.2. Хлорэтиламины (азотистые иприты), применяемые в клинике.

Дакарбазин активируется микросомальными ферментами печени путем отщепления от атома азота одной из метильных групп. В опухолевых клетках от образовавшегося вещества спонтанно отделяется алкилирующий фрагмент — катион метилдиазония. Близкий по строению триазен темозоломид активируется спонтанно; этот препарат применяется при глиомах и меланоме (Agarwala and Kirkwood, 2000). Его структурная формула следующая:

К производным нитрозомочевины относятся кармустин 11,3-бис-(2-хлорэтил)-1 -нитрозомочевина], ломустин [ 1 -(2-хло-рэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина], его метильное производное семустин, а также противоопухолевый антибиотик стрептозоцин. Эти препараты спонтанно распадаются на алкилирующий и карбамоилирующий фрагменты (рис. 52.4). Структурная формула кармустина следующая:

Все производные нитрозомочевины, обладающие противоопухолевой активностью, спонтанно распадаются, выделяя алкилирующий фрагмент — хлорэтильный карбкатион. Это сильный электрофил, быстро связывающийся с различными молекулами, включая гуанин, цитозин и аденин (Ludlum, 1990). После присоединения к ДНК он может отщеплять хлор и образовывать сшивки внутри одной цепи или между двумя цепями ДНК. Эта реакция протекает относительно медленно, и ДНК может быть восстановлена метилгуанин-ДНК-метилтрансферазой (Dolan et al., 1990). Усиленный синтез данного фермента в глиомах сопровождается устойчивостью к производным нитрозомочевины и препаратам, метилирующим ДНК (дакарбазину, темозоломиду и прокарбазину). Как и в случае хлорэтиламинов, цитотоксичность производных нитрозомочевины связывают со сшивкой цепей ДНК (Hemminki and Ludlum, 1984). Кроме карбкатиона при распаде кармустина, ломустина и семустина образуется замещенный изоцианат, карбамоилирующий остатки лизина в белках. В результате последней реакции, по-видимому, инактивируются ряд ферментов, участвующих в репарации ДНК.

Рисунок 52.4. Механизм действия кармустина.

Поскольку действие хлорэтиламинов начинается с образования положительно заряженного этилениминового кольца, не удивительно, что стабильные этиленимины также обладают противоопухолевой активностью. Ряд соединений из этой группы, включая триэтиленмеламин и ТиоТЭФ, применяется в клинике. В стандартных дозах практически единственным побочным действием ТиоТЭФ является угнетение кроветворения, поэтому он широко используется при высокодозной химиотерапии. Альтре-тамин (гексаметилмеламин) рассматривается в этом разделе из-за его структурного сходства с триэтиленмеламином. Альтре-тамин активируется микросомальными ферментами печени (Friedman, 2001), которые деметилируют его с выделением формальдегида. Выявлена связь между степенью деметилирования и противоопухолевой активностью препарата у мышей.

Представляет интерес ряд соединений из обширной группы эфиров алкансульфоновых кислот. Одно из них, бусульфан, используется при хроническом миелолейкозе и при высокодозной химиотерапии. Его структурная формула следующая:

Бусульфан относится к симметричным эфирам метансуль-фоновой кислоты и двухатомных спиртов. Получены эфиры спиртов с длиной цепи от 2 до 10 атомов углерода, наибольшая активность и терапевтический диапазон достигаются при промежуточном числе атомов (4 или 5). При инкубации с ДНК in vitro бусульфан образует сшивки между гуанинами (Tong and Ludlum, 1980).

=== Механизм действия === 

Мы рассмотрим механизмы действия всех алкилирующих средств в одном разделе. Хотя в их действии много общего, следует указать на ряд важных различий. 

==== Цитотокснческое действие ====

Основной фармакологический эффект алкилируюших средств — нарушение репликации ДНК и деления клеток. Способность этих препаратов повреждать ДНК в быстро делящихся клетках объясняет как их противоопухолевое действие, так и многие побочные эффекты. В первую очередь страдают ткани с высоким пролиферативным индексом, но некоторые препараты повреждают и те ткани, где этот индекс невелик (печень, почки), а также зрелые лимфоциты. Хотя алкилированию подвергаются и покоящиеся клетки, цитотоксичность резко усиливается, если ДНК повреждается во время подготовки клетки к делению. Если системы репарации успевают устранить повреждение ДНК до начала деления, то гибели клетки не происходит.

В отличие от многих других противоопухолевых препаратов апеллирующие средства действуют на клетки во всех периодах клеточного цикла. Тем не менее это действие обычно проявляется при вступлении клетки в период S — клеточный цикл останавливается. На синхронизированной культуре клеток можно выявить, что клетки несколько более чувствительны к хлорэтиламинам в конце периода G [ и в периоде S, чем в митозе, в периоде G2 и в начале периода G,. Дело в том, что неспаренные нуклеотиды сильнее подвержены алкилированию, чем нуклеотиды в спирализованной ДНК, а во время репликации цепи ДНК на отдельных участках расплетаются.

Механизм гибели клетки при алкилировании ДНК детально не изучен. Показано, что в нормальных клетках костного мозга и слизистой ЖКТ повреждение ДНК вызывает остановку клеточного цикла на границе периодов G) и S, после чего происходит репарация ДНК или, если ДНК повреждена слишком сильно, развивается апоптоз. Эти процессы регулирует белок р53, и при мутации или делеции гена ТР53 опухолевые клетки избегают апоптоза и продолжают пролиферировать (Fisher, 1994; Kastan, 1999).

Хотя основной мишенью всех алкилирующих средств служит ДНК (рис. 52.1), следует указать на важные различия между бифункциональными и монофункциональными препаратами. Первые образуют сшивки цепей Д Н К и оказывают главным образом цитотокснческое действие, тогда как вторые (прокарбазин, темозоломид) метилируют ДНК и наряду с цитотоксичностью обладают резко выраженной мутагенностью и канцерогенностью. Очевидно, сшивки цепей ДНК более губительны для клетки, чем метилирование отдельных пуриновых оснований с их последующим отщеплением и разрывом цепи ДНК. Метилирование совместимо с жизнью клетки, но оно чревато мутациями, которые, передаваясь дочерним клеткам, могут вызвать злокачественное перерождение.

Большинство клеток способно к репарации ДНК; по-видимому, репарация играет большую роль в низкой чувствительности покоящихся клеток к алкилирующим средствам, в избирательности действия этих средств на различные типы клеток и в развитии устойчивости. Алкилирование одной цепи ДНК обычно устраняется достаточно легко, но сшивка цепей, возникающая, например, при действии хлорэтиламинов, требует более сложных систем репарации. На фоне низких доз этих препаратов клетка может устранить часть сшивок, но при повышении дозы их число резко возрастает, вызывая распад ДН К. Найдены ферменты репарации (Matijasevic et al., 1993), отщепляющие алкильные группы от атома 0-6 гуанина (метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза), от атомов N-3 аденина и N-7 гуанина (3-ме-тиладенин-ДНК-гликозилаза). Высокая активность метилгуа-нин-ДНК-метилтрансферазы обеспечивает клетке устойчивость к производным нитрозомочевины и триазенам (Pegg, 1990).

Механизм проникновения алкилирующих средств в клетки-мишени изучен недостаточно. Хлорметин, по-видимому, попадает в клетки опухолей мышей путем активного транспорта, как аналог холина. Мелфалан, будучи аналогом фенилаланина, переносится по меньшей мере двумя системами активного транспорта, в норме переносящими лейцин и другие нейтральные аминокислоты. Липофильные препараты (производные нитрозомочевины, кармустин и ломустин) проникают в клетки путем диффузии.

==== Механизмы устойчивости ====

К алкилирующим средствам часто развивается устойчивость; нередко она оказывается перекрестной, но так бывает не всегда, поэтому сочетание различных алкилирующих средств при высокодозной химиотерапии теоретически обосновано. Механизмы устойчивости до конца не ясны, однако ее связывают с развитием в опухолевых клетках специфических биохимических изменений (Tew et al., 2001), включая: 1) снижение активного транспорта препарата (например, хлорметина и мелфалана), 2) увеличение синтеза нуклеофильных вешеств, прежде всего тиолов (например, глутатиона), которые связывают и инактивируют электрофилъные метаболиты алкилируюших средств, 3) повышение активности ферментов парации ДНК (например, метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы, отшепляющей от ДНК алкильные группы после действия производных нитрозомочевины) и 4) ускоренное окисление альдегиддегидрогеназой активных метаболитов циклофосфамида в неактивные кето- и карбоксипроизводные (рис. 52.3).

Для преодоления лекарственной устойчивости предложен ряд веществ, включая соединения, истощающие запасы глутатиона (L-бутионинсульфоксимин); тиолы, которые избирательно связывают активные метаболиты алкилирующих средств в здоровых тканях, снижая токсичность (амифостин); ингибиторы метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (О-6-бензипгуанин) и ингибиторы глутатионтрансфераз — ферментов, ускоряющих конъюгацию тиолов с алкилирующими средствами (этакриновая кислота). Хотя все эти вещества активны при некоторых экспериментальных опухолях, их клиническая эффективность пока не доказана. Только О-6-бензилгуанин (в сочетании с карму-стином или прокарбазином) проходит испытания 2-й фазы при злокачественных глиомах (Schilsky et al., 2000).

=== Побочные эффекты === 

Алкилирующие средства различаются не только по противоопухолевой активности, но и по характеру и тяжести побочных эффектов. Большинство препаратов сильно угнетают кроветворение, в меньшей степени страдают слизистые. Хлорметин, мелфалан, хлорамбуцил, циклофосфамид и ифосфамид вызывают раннюю нейтропению: число нейтрофи-лов снижается до минимума на 6—10-е сутки и восстанавливается на 14—21-е сутки. Циклофосфамид реже других препаратов вызывает тромбоцитопению. Бусульфан угнетает все ростки кроветворения, прежде всего стволовые клетки, поэтому его назначают перед аллотрансплантацией костного мозга. При лечении бусульфаном возможна стойкая кумулятивная панцитопения, длящаяся месяцами. Кармустин и ломустин вызывают отсроченную тромбоцитопению и нейтропению, которые достигают максимума через 4—6 нед и затем постепенно проходят.

Алкилирующие средства угнетают клеточный и гуморальный иммунитет, поэтому их применяют при аутоиммунных болезнях. На фоне стандартных доз угнетение иммунитета обратимо.

Кроме системы кроветворения алкилирующие средства поражают быстро делящиеся клетки слизистых, вызывая стоматит и слущивание слизистой кишечника. Особенно важную роль поражение слизистой ЖКТ играет при высокодозной химиотерапии с трансплантацией костного мозга, поскольку это осложнение чревато развитием сепсиса. Мелфалан и ТиоТЭФ в меньшей степени действуют на слизистые, чем другие средства. При высокодозной химиотерапии на первый план выходят другие побочные эффекты, чем при назначении стандартных доз (табл. 52.1).

Другие органы поражаются реже, чем костный мозг и слизистые, но возникающие в них изменения могут быть необратимыми и даже вести к смерти. Все алкилирующие средства вызывают пневмосклероз, при высокодозной химиотерапии встречается поражение эндотелия с развитием вено-окклюзивной болезни печени, длительное лечение производными нитрозомочевины чревато почечной недостаточностью, ифосфамид в высоких дозах часто поражает ЦНС, вызывая эпилептические припадки, кому и иногда смерть. Все эти препараты могут стать причиной вторичных лейкозов, особенно прокарбазин (метилирующее средство) и производные нитрозомочевины. При метаболизме циклофосфамида и ифосфамида образуется акролеин, вызывающий поражение почек и тяжелый геморрагический цистит. Предотвратить последний помогает месна (2-меркапто-этансульфонат) — она содержит сульфгидрильную группу и связывает акролеин в моче.

Нестабильные алкилирующие средства — хлорметин и производные нитрозомочевины — обладают сильным кожно-нарывным действием (благодаря чему хлорметин с успехом применяется местно при опухолях кожи, например грибовидном микозе), при длительном использовании вызывают флебит, а при попадании в ткани — изъязвление. Большинство алкилирующих средств вызывают алопецию.

Поражение ЦНС проявляется тошнотой и рвотой, особенно после в/в введения хлорметина или кармустина. Наиболее нейротоксичен ифосфамид: он вызывает угнетение сознания вплоть до комы, эпилептические припадки и паралич. Это объясняют образованием хлорацетальдегида из хлорэтильной группы, связанной с оксазафосфориновым кольцом. Высокие дозы бусульфана также иногда вызывают эпилептические припадки; кроме того, он ускоряет элиминацию противосудорожного препарата фенитоина (гл. 21).

Алкилирующие средства значительно повышают риск вторичных лейкозов. Почти у 5% больных возникает острый мие-лолейкоз, нередко связанный с делециями 5q или 7q или моно-сомией по 5-й или 7-й хромосоме; заболеваемость достигает максимума через 4 года после химиотерапии (Levine and Bloomfield, 1992). Вторичные лейкозы чаще вызывают мелфалан, производные нитрозомочевины и прокарбазин; для циклофосфамида они менее характерны.

Наконец, алкилирующие средства нарушают репродуктивную функцию у мужчин и у женщин, вызывая необратимую азооспермию и аменорею (особенно у женщин в пременопаузе).