4702
правки
Изменения
Нет описания правки
== Спектрофотометрическое исследование продуктов нингидриновой реакции ==
Разработка точных, доступных методов анализа а-[[Аминокислоты|аминокислот ]] является одной из актуальных задач современной фармации.
В настоящее время существует ряд методов количественного определения а-аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [1—31]. Однако, несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов (потенциометрическое титрование в неводной среде), дороговизной оборудования (ГЖХ, ВЭЖХ) [4, 6,27,28, 30].
Khan А. с соавторами изучили механизм нингидриновой реакции [29]:
[[Image:Ningidrid.jpg|250px|thumb|right|Нингидриновая реакция]]
На первой стадии реакции о-аминокислот с нингидрином (I) образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение - 2-аминоиндандион (II), участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона (III) и 2-иминоиндандиона (IV), которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин (V). Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин (VI).
Широкое распространение в анализе аминокислот получили аминокислотные анализаторы [1,9,11,13—15, 17]. Данный метод основан на разделении аминокислот с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции аминокислот с нингидрином. Применение аминокислотных анализаторов позволяет разделить исследуемый образец на отдельные компоненты и определить их количество быстро и с высокой точностью. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий.
Более доступными и простыми являются фотоколориметр ические фотоколориметрические и спектрофотометрические методы анализа о-аминокислот, основанные на их взаимодействии с нингидрином. Так, В.А. Храмовым модифицирован метод определения диаминокислот по Чинарду [12]. Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин.
Разработана точная методика количественного определения кислоты аспарагиновой в лекарственном препарате «Аспаркам», основанная на ее взаимодействии с 1 % этаноловым раствором нингидрина и последующим определением оптической плотности продукта реакции при длине волны 568 нм. Метод отличается хорошей воспроизводимостью, относительная ошибка среднего результата составила ±2,25 % [19]. Кроме того, предложен спектрофотометрический метод анализа суммы аминокислот различных видов пыльцы, основанный на взаимодействии с 2 % этаноловым раствором нингидрина [11].
Исследование спектров поглощения в видимой области показало наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 399-405 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 19-ти из 20-ти а-аминокислот (рис. 1-4). Исключение составляет пролин, продукт реакции которого с нингидрином имеет один максимум поглощения в видимой области — при длине волны 416 нм, что объясняется отсутствием первичной аминогруппы в структуре данной аминокислоты.
[[Image:Ningidr1.jpg|250px|thumb|right|Рис 1. Видимая область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
[[Image:Ningidr2.jpg|250px|thumb|right|Рис 12. Видимая область спектра продуктов взаимодействия оа-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
[[Image:Ningidr3.jpg|250px|thumb|right|Рис 23. Видимая область спектра продуктов взаимодействия dfа-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
Исследована также УФ-область спектра продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и установлено, что все они также имеют два максимума поглощения в диапазонах длин волн 220-237 и 254-260 нм (рис. 5-8). Исключение составляет продукт реакции с пролином, максимумы поглощения которого составляют 299 и 343 нм.
[[Image:Ningidr5.jpg|250px|thumb|right|Рис 5. УФ-область спектра продуктов взаимодействия а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
[[Image:Ningidr6.jpg|250px|thumb|right|Рис 56. УФ-область спектра продуктов взаимодействия о-а аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
[[Image:Ningidr7.jpg|250px|thumb|right|Рис 67. УФ-область спектра продуктов взаимодействия о а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне]]
Максимумы поглощения (в видимой и УФ-области) продуктов взаимодействия 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне представлены в таблице 1.
<tr><td>
<p>1</p></td><td>
<p>[[Бета-аланин|Аланин]]</p></td><td>
<p>231,251</p></td><td>
<p>401, 567</p></td></tr>
<tr><td>
<p>2</p></td><td>
<p>[[Аргинин]]</p></td><td>
<p>232,256</p></td><td>
<p>400, 561</p></td></tr>
<tr><td>
<p>4</p></td><td>
<p>[[D-аспарагиновая кислота|Аспарагиновая кислота]]</p></td><td>
<p>230, 256</p></td><td>
<p>400,564</p></td></tr>
<tr><td>
<p>6</p></td><td>
<p>Г истидин[[Гистидин]]</p></td><td>
<p>229, 255</p></td><td>
<p>401, 568</p></td></tr>
<tr><td>
<p>7</p></td><td>
<p>[[Глицин]]</p></td><td>
<p>231,256</p></td><td>
<p>401,568</p></td></tr>
<tr><td>
<p>8</p></td><td>
<p>[[Глутамин]]</p></td><td>
<p>230, 256</p></td><td>
<p>401,566</p></td></tr>
<tr><td>
<p>13</p></td><td>
<p>[[Метионин]]</p></td><td>
<p>230, 254</p></td><td>
<p>401,566</p></td></tr>
<tr><td>
<p>14</p></td><td>
<p>СерииСерин</p></td><td>
<p>230, 256</p></td><td>
<p>401,567</p></td></tr>
<tr><td>
<p>15</p></td><td>
<p>[[Треонин]]</p></td><td>
<p>230, 256</p></td><td>
<p>402,567</p></td></tr>
<tr><td>
<p>16</p></td><td>
<p>[[Тирозин]]</p></td><td>
<p>228, 258</p></td><td>
<p>400, 567</p></td></tr>
<tr><td>
<p>17</p></td><td>
<p>[[Триптофан]]</p></td><td>
<p>229,263</p></td><td>
<p>401,568</p></td></tr>
<tr><td>
<p>18</p></td><td>
<p>[[Цистеин]]</p></td><td>
<p>230, 257</p></td><td>
<p>401,566</p></td></tr>
<tr><td>
<p>19</p></td><td>
<p>[[Фенилаланин]]</p></td><td>
<p>230, 255</p></td><td>
<p>401, 564</p></td></tr>
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№</p><p>п/п</p></td><td colspan="3">
<p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td rowspan="2">
<p>Разведен</p><p>ие</p><p>Разведение продукта</p><p>реакции</p><p>водой</p></td><td colspan="2"><p>Оптическая плотность продукта при Лλ=400 нм</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Навеска фенилала нина, г</p></td><td>
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№</p><p>п/п</p></td><td rowspan="2">
<p>Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2">
<p>Разведение</p><p>продукта</p><p>реакции</p><p>водой</p></td><td colspan="2"><p>Оптическая плотность продукта при Хλ=400 нм</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>I №</p><p>п/п</p></td><td rowspan="2">
<p>Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2">
<p>Разведение</p><p>продукта</p><p>реакции</p><p>водой</p></td><td colspan="2"><p>Оптическая плотность продукта при Хгλ=400 нм</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
С целью выявления подчинения закону светопоглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне при длине волны 400 нм нами исследована зависимость светопоглощения от концентрации а-аминокислоты (рис. 9).
[[Image:Ningidr9.jpg|250px|thumb|right|Рис 9. Калибровочный график продукта реакции метионина]]
На рис. 9 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия метионина с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне подчиняется закону светопоглощения при длине волны 400 нм в концентрациях от 0,005 до 0,02 мг/мл.
На этом основании нами изучены продукты нингидриновой реакции в нелетучем растворителе - диметилсульфоксиде (ДМСО).
== Исследование реакции оа-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в диметилсульфоксиде ===
В следующей серии экспериментов в качестве растворителя для нингидрина мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Растворы нингидрина в ДМСО часто используют для количественного определения аминокислот с помощью аминокислотных анализаторов [1]. Важно отметить, что ДМСО имеет преимущества по сравнению с ацетоном: данный растворитель нелетучий, имеет невысокую токсичность, взрыво- и пожаробезопасен, что обеспечивает удобство его использования.
По аналогии с ацетоновым раствором нингидрина, нами изучена зависимость светопоглощения продукта реакции с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО от концентрации а-аминокислоты при длине волны 400 нм и установлено её подчинение закону светопоглощения Бугера - Ламберта - Бера (рис. 10).
[[Image:Ningidr10.jpg|250px|thumb|right|Рис 10. Калибровочный график продукта реакции глицина]]
На рис. 10 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт реакции глицина с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО при длине волны 400 нм подчиняется закону светопоглощения в концентрации глицина от 0,03 до 0,19 мг/мл.
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td>
<p>№</p><p>п/п</p></td><td>
<p>Длина волны, нм</p></td><td>
<p>Значение оптической плотности</p></td></tr>
Для качественного и количественного анализа а-аминокислот достаточно часто используют водный раствор нингидрина [7, 13, 20]. На этом основании нами исследованы спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина после его нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин и установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220-300 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм (рис. 11).
[[Image:Ningidr11.jpg|250px|thumb|right|Рис 11. Спектр поглощения водного раствора нингидрина после нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин]]
Учитывая, что вода является наиболее доступным и безопасным растворителем, наиболее целесообразно проводить спектрофотометрическое исследование продуктов реакции с 0,2 % водным раствором нингидрина в видимой области спектра в диапазоне длин волн - от 400 до 600 нм.
Исключение составляют продукты реакции с цистеином, пролином и гистидином. Продукт реакции с цистеином характеризуется низкой интенсивностью поглощения в видимой области и имеет максимум при длине волны 450 нм. Пролин -единственная о-аминокислота, в структуре которой отсутствует первичная аминогруппа, этим объясняется отсутствие характерного (при 400 нм) максимума поглощения в видимой области спектра. Однако в диапазоне 395-402 нм отмечается четкое плечо с достаточно интенсивным поглощением. Продукт реакции с гистидином имеет недостаточную интенсивность поглощения в видимой области спектра. Важно отметить, что большинство продуктов реакции характеризуются единым максимумом поглощения при 400 нм (рис. 12-15).
[[Image:Ningidr12.jpg|250px|thumb|right|Рис 12. Спектры поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
[[Image:Ningidr14.jpg|250px|thumb|right|Рис 14. Спектры поглощения продуктов реакции оа-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
[[Image:Ningidr15.jpg|250px|thumb|right|Рис 15. Спектры поглощения продуктов реакции о;а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина]]
Таким образом, наиболее целесообразно проводить реакцию с использованием водного раствора нингидрина с последующим определением оптической плотности её продукта при длине волны 400 нм.
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td>
<p>№</p><p>п/п</p></td><td colspan="3">
<p>Количественные соотношения между компонентами реакции</p></td><td>
<p>Разведени</p>
<p>е</p></td><td colspan="2">
<p>Оптическая плотность продукта при Хλ=400 нм</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p>Навеска</p><p>глицина,</p><p>г</p></td><td>
<p>Объем раствора глицина, мл</p></td><td>
<p>Объем 0,2 % водного раствора нингидрина, мл</p></td><td>
<table cellpadding="7" border="1">
<tr><td rowspan="2">
<p>№</p><p>п/п</p></td><td rowspan="2"><p>Температур ный Температурный режим реакции, °С</p></td><td rowspan="2"><p>Продолжитель ность Продолжительность проведения реакции, мин</p></td><td rowspan="2"><p>Разведение</p><p>продукта</p><p>реакции</p><p>водой</p></td><td colspan="2"><p>Оптическая плотность продукта при Хλ=400 нм</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Через 1 ч после начала реакции</p></td><td>
На основании оптимизированных условий проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина нами была изучена зависимость светопоглощения продукта реакции от концентрации о-аминокислоты при длине волны 400 нм (рис. 16).
[[Image:Ningidr16.jpg|250px|thumb|right|Рис 16. Калибровочный график продукта реакции глицина]]
На рис. 16 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия глицина с 0,2 % водным раствором нингидрина подчиняется закону светопоглощения в концентрации от 0,005 до 0,025 мг/мл.
== Заключение ==
Таким образом, на основании исследования спектральных характеристик продуктов реакции fа-аминокислот с нингидрином в различных растворителях установлены единые максимумы поглощения для большинства а-аминокислот: в УФ- (в диапазоне длин волн 220-260 нм) и видимой областях спектра (при длине волны 400±2 нм, а также в диапазоне длин волн 560-570 нм).
Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции показала, что продукты реакции а-аминокислот с водным раствором нингидрина характеризуются наибольшей стабильностью во времени и имеют единый максимум поглощения при длине волны 400±2 нм. Поэтому, наиболее целесообразно проводить нингидриновую реакцию с водным раствором нингидрина, с последующим спектрофотометрическим определением продуктов при длине волны 400 нм.